里氏木霉銅代謝相關基因克隆與功能分析.pdf

1、木霉菌是土壤中普遍存在的習居菌，在植物病害生物防治和土壤農化污染修復中具有廣泛的應用。然而木霉菌在與銅制劑農藥協(xié)同防治植物病害、與肥料復合使用提高作物產量及修復重金屬污染環(huán)境中，需要具備良好的銅耐受性或吸附性。因此，研究木霉銅代謝相關基因及其功能，揭示木霉菌耐受、吸附和轉運銅的機理，為提高木霉菌在銅脅迫下的防病、修復環(huán)境效應奠定理論基礎，對構建高效吸附或高耐受銅的工程菌也具有重要意義。本研究以基因組已測序的里氏木霉（Trichoderm

2、areesei）QM6a為原始菌，克隆銅代謝相關基因，并通過改進的農桿菌介導轉化技術(ATMT)構建、篩選高吸附銅的里氏木霉突變株，克隆高吸附銅相關基因，在遺傳、生物化學和組學的尺度上明確其代謝功能和作用機制。主要的研究內容如下:
　　 1.高吸附銅突變株的構建與篩選
　　 對常規(guī)的農桿菌介導(ATMT)轉化方法進行了改進，建立了一種高效篩選吸附銅突變株的方法。通過該方法，構建了1664株突變株，并從中篩選到一株高吸附銅

3、突變株AT01，當培養(yǎng)基銅濃度為0.7mM時，AT01銅吸附率達到12.73mg/g(96.1％)，而野生株(WT)吸附率僅為5.97mg/g(49.6％)。顯微鏡觀察表明，AT01突變株胞內液泡數(shù)量明顯多于WT，在銅脅迫下可富集較多的銅離子，胞內多余的銅離子儲存在液泡中可減少銅對細胞的毒性作用，進而提高木霉菌對銅的耐受能力。
　　 2.Tad1基因克隆與功能分析
　　 通過反向PCR擴增獲得的T-DNA插入片段側翼序列

4、并通過NCBI比對分析后獲得基因Tad1。分析表明，該基因讀碼框含1533bp堿基，無內含子，在里氏木霉中為單拷貝，編碼一個510氨基酸的蛋白，屬于COG0420，為酰胺水解酶超家族成員。原核表達產物純化后，進行酶活測定，結果表明:以腺嘌呤為底物時，酶活性最高，Km為0.66mM。RNA介導基因沉默和過表達分析表明:在1mM銅脅迫下，WT、AT01、過表達子(Ovex-Tad1)及沉默子(RNAi-Tad1)的銅吸附水平分別為7.5、1

5、4.1、12.3及4.9mg/g(P值為0.02，T-test)。在同濃度銅脅迫下，通過熒光定量PCR分析了RNAi-Tad1、Ovex-Tad1及AT01、WT中已知的酵母菌銅代謝相關基因的表達水平，結果表明:Trace、Trccs、Tratx、Trcox四個基因在Ovex-Tad1和AT01中均上調表達，而在RNAi-Tad1中，這些基因表達水平與野生株無明顯差異。進一步通過HPLC分析WT、AT01、Ovex-Tad1、RNAi-

6、Tad1中可與銅相結合的次黃嘌呤、黃嘌呤產生水平，發(fā)現(xiàn)與WT相比，Ovex-Tad1和AT01中兩種次生代謝產物的產生均明顯增加，而RNAi-Tad1產量低于野生株。上述研究從遺傳和生化水平上說明該基因參與里氏木霉對銅的吸附過程。
　　 3.Tad1基因對銅代謝相關基因的調控作用
　　 通過表達譜芯片技術分析了AT01與WT在1mM銅脅迫下基因表達水平的差異，共獲得624個上調基因，305個下調基因。根據(jù)NCB(I)對基

7、因功能的分析，上調基因共分為22類。其中與銅代謝相關的基因主要有三類:(1)調控胞內離子平衡的基因。如胞內轉運，細胞器跨膜運輸相關基因26個(4.2％)，無機離子運輸及代謝相關基因25個(4.0％)。(2)耐受和解除重金屬毒性作用的相關基因，如細胞解除重金屬毒性相關基因有11個(1.8％);與細胞耐受脅迫反應相關基因有11個(1.8％);與細胞壁合成，細胞器的膜合成相關基因有8個(1.3％)，這些基因可能參與銅的跨膜運送。對這8個基因進

8、行了基因敲除，結果表明，其中一個基因被敲除后，菌體在銅脅迫下生長受到抑制，而且銅的吸附能力也低于WT，該基因功能有待進一步研究。(3)腺嘌呤脫氨酶功能及腺嘌呤代謝相關基因9個(1.4％)。為驗證上述基因的表達水平，選擇了上述銅代謝及腺嘌呤代謝相關基因中差異最顯著的8個基因進行RT-PCR分析:①鐵氧化酶蛋白(Fet3p)，催化二個鐵氧化成三價鐵，1分子該酶需要4分子銅作為輔基。酵母菌研究表明，胞外銅離子濃度變化對該酶活性有明顯影響。②谷

9、胱甘肽轉移酶，廣泛分布于生物體內具多種功能的超家族酶，是真菌胞內非常重要的銅解毒肽類物質。主要催化谷胱甘肽(GSH)的結合反應。③細胞色素C氧化酶，存在線粒體內膜，是細胞呼吸鏈中非常關鍵的一個酶，在動物細胞凋亡過程起重要作用。該酶催化功能需要銅離子作為輔基。④Cccs同源蛋白。Cccs蛋白是酵母細胞內小分子多肽，主要功能是負責將胞內銅離子運送到SOD酶（超氧化物歧化酶）。與胞內銅解毒功能密切相關。⑤Tctr2基因，編碼一個Ctr2同源基

10、因，該基因在釀酒酵母中與亞銅離子液泡儲存相關。⑥尿囊素酶基因，該基因催化尿囊素轉變成尿囊酸，為腺嘌呤分解代謝下游關鍵酶。⑦磷酸核糖甲酰甘氨脒合酶屬于腺嘌呤代謝途徑中分支途徑中一個酶，催化磷酸核糖焦磷酸(PRPP)轉變?yōu)?(')單磷酸鹽肌苷(IMP)。⑧GTP（三磷酸鳥苷）環(huán)水解酶，催化GTP水解為單磷酸黃苷，腺嘌呤代謝途徑中分支途徑中一個酶。結果表明，與野生株相比，這些基因在過表達子和AT01中表達水平都比野生株提高2倍以上。
　

11、　 4.胞內銅轉運相關基因克隆及功能分析
　　 首次在里氏木霉菌中克隆并驗證6個銅代謝調控因子及功能基因:Tmac1、Trace、Tctr3、Trccs、Tratx、Trcox。其中Tmac1與釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)Mac1蛋白同源，胞內高親和銅轉運調控因子;Trace與酵母Ace1蛋白同源，控制胞內金屬蛋白的表達，參與胞內銅毒性的解毒;Tctr3與酵母跨膜蛋白Ctr3同源，參與銅的跨膜轉運

12、;Trccs與酵母Ccs1蛋白同源，特異性將銅轉運到胞質中的抗氧化酶SOD;Tratx與酵母Atx1蛋白同源，能夠與亞銅離子結合形成二聚體，將其傳遞給高爾基體;Trcox與酵母Cox17蛋白同源，通過兩個中間蛋白因子介導，將亞銅離子傳遞給細胞色素C氧化酶。進一步研究表明Tmac1基因編碼一個501氨基酸的蛋白。在蛋白C端具兩個Cys-His重復序列結構，與銅結合有關。敲除該基因后，木霉菌生長緩慢且對銅饑餓敏感，基因回補后，功能得到完全恢

13、復。將該基因回補到酵母突變株(⊿)Mac1能完全恢復酵母突變株耐受銅饑餓能力。Trace基因編碼一個含405氨基酸的蛋白，蛋白含4個CXXC結構域，與銅結合有關。同時在蛋白N端含銅依賴型DNA結合結構域CVRGHR。酵母回補實驗表明，該基因能夠完全恢復酵母(⊿)Ace1的功能。Tctr3蛋白含178個氨基酸，具有3個跨膜結構域，N端含保守結構域MLLAM。Trccs、Tratx、Trcox分別編碼三個小分子銅分子伴侶。Trccs編碼24

14、8個氨基酸的蛋白，N端含保守結構域CXXCV，與銅結合功能相關酵母胞內銅相關分子伴侶同源。Tratx編碼一條含82氨基酸的蛋白，N端具有保守結構域MTCXXC。Trcox編碼61個氨基酸的蛋白。另外，Trace、Trccs、Tratx、Trcox這四個基因的表達水平變化可用于監(jiān)測細胞內銅離子濃度的變化。
　　 綜合上述實驗結果提出Tad1基因參與木霉菌銅吸附和胞內銅代謝可能途徑為:腺嘌呤脫氨酶（Tad1基因編碼）催化木霉胞內腺嘌