FIAU用于心臟報告基因顯像的實驗研究.pdf

1、目的:制備125I-FIAU，培養(yǎng)原代心肌細胞，構建含HSV1-tk的腺病毒重組體，通過一系列實驗評價心肌細胞對該腺病毒重組體的易感性及感染后的活力，評估感染滴度及感染時間對心肌細胞體外攝取125I-FIAU的影響，為進一步探討用腺病毒作為載體、HSV1-tk作為標志性基因、放射性核素標記的FIAU作為標志性底物進行心臟報告基因顯像的可行性打下基礎。
　　 方法:
　　 1. FAU的碘化標記及其在昆明小鼠體內(nèi)的生物分布

2、研究利用Iodogen固相氧化法碘化標記FAU，標記反應產(chǎn)物用Sep-Pak C18反相色譜柱進行純化，用硅膠板薄層層析法測定125I-FIAU的放射化學純度和體外穩(wěn)定性，并研究其在昆明小鼠體內(nèi)的生物分布情況，著重分析在心肌及血液中的分布特性。
　　 2. 原代SD大鼠乳鼠心肌細胞的培養(yǎng)及鑒定取1～3d齡的SD大鼠乳鼠的心室組織，切成1mm3的小塊采用含牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）的Ⅱ型膠原酶

3、單次消化心肌，1h后用差速貼壁法純化心肌細胞后培養(yǎng)，全過程在25℃-37℃條件下進行。在生物倒置顯微鏡下動態(tài)觀察培養(yǎng)的心肌細胞的形態(tài)，用免疫組織化學染色的方法進行純度測定。
　　 3. Ad-CMV-HSV1-tk重組體的制備及鑒定用HSV1-tk作為報告基因，用巨細胞病毒作為啟動子，腺病毒作為載體，構建腺病毒重組體，本部分與北京本元正陽公司合作。
　　 4.感染Ad5-tk的心肌細胞活性及感染滴度和感染時間對其體外攝取

4、125I-FIAU的影響。應用腺病毒重組體將HSV1-tk基因轉(zhuǎn)染到心肌細胞中，用MTT的方法評價心肌細胞感染病毒重組體后的活力，分析細胞活力與感染滴度的關系；用RT-PCR的方法監(jiān)測心肌細胞感染病毒重組體后有無HSV1-tk mRNA存在，并在更換含125I-FIAU的培養(yǎng)基后分別于0.5h、1h、2h、3h、4h、5h時測定不同感染滴度下的心肌細胞對125I-FIAU的攝取率，分析攝取率與感染滴度和感染時間的相關性。
　　

5、結(jié)果:
　　 1. Iodogen固相氧化法能有效碘化標記FAU，標記反應產(chǎn)物經(jīng)Sep-Pak C-18反相色譜柱純化后，125I-FIAU的放射化學純度為98.60%±0.52%（n=5）；125I-FIAU在正常人血清及PBS中37℃條件下穩(wěn)定，在0.5h～24h的時段內(nèi)放射化學純度>95％。生物分布實驗顯示，125I-FIAU從血液中清除迅速，腎臟是主要排泄器官，心肌24h后幾乎無滯留。
　　 2. 用含牛血清白蛋

6、白（bovine serum albumin，BSA）的Ⅱ型膠原酶單次消化心肌，心肌組織在6 h時基本消化完全。5、10、15、20、25和30天時臺盼蘭染色法計算得到心肌細胞存活率均大于95％，30 d時仍為95.2％；生物倒置顯微鏡下觀察，24 h左右心肌細胞之間形成交聯(lián)，并有細胞搏動；培養(yǎng)48 h的細胞經(jīng)免疫組織化學染色法測定心肌細胞純度為(97.1±1.9)％。
　　 3.與本元正陽公司協(xié)作構建腺病毒重組體，pDC316

7、-tk質(zhì)粒經(jīng)PCR、酶切鑒定和測序鑒定證明序列正確，得到Ad-CMV-HSV1-tk腺病毒重組體的物理滴度為1.1×1012，感染滴度達到1.6×1010。
　　 4. MTT實驗結(jié)果顯示，心肌細胞感染腺病毒重組體后的活力與感染滴度存在負相關的關系；RT-PCR結(jié)果顯示，心肌細胞感染腺病毒重組體后有HSV1-tk mRNA存在。攝取率結(jié)果顯示，腺病毒重組體感染后的心肌細胞體外對125I-FIAU的攝取率與感染滴度和感染時間呈明顯

8、正相關關系。
　　 結(jié)論: 用Iodogen固相氧化法和Sep-Pak C-18反相色譜柱純化可以快速制備符合實驗要求的125I-FIAU，并且所制備的125I-FIAU具有較好的生物分布特性。應用改良的方法可以更簡單的培養(yǎng)出符合大多數(shù)實驗要求的心肌細胞。用腺病毒重組體做載體，可以將HSVI-tk基因成功轉(zhuǎn)導入心肌細胞，并且對125I-FIAU有較高的攝取率。因此，用腺病毒重組體作為載體，HSV1-tk作為標志性基因，125I-