前列腺癌特異DD3 mRNA熒光定量方法的建立和初步應(yīng)用研究.pdf

1、前列腺癌（PCa）是西方國(guó)家男性中最常見(jiàn)的腫瘤之一，占癌癥死亡率的第二位。隨著人類(lèi)平均壽命的延長(zhǎng)和診斷技術(shù)的提高，前列腺癌的發(fā)病率和檢出率在不斷上升。我國(guó)前列腺癌的發(fā)病率雖然低于西方發(fā)達(dá)國(guó)家，但其增長(zhǎng)也呈明顯的上升趨勢(shì)。前列腺穿刺活檢是前列腺癌診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，但是血清PSA>4ng/ml時(shí)穿刺陽(yáng)性率只有1/3。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的人血管舒緩素激肽釋放酶2和前列腺干細(xì)胞抗原也被證實(shí)為前列腺癌特異性基因，但它們并不能提高前列腺癌的特異診斷方法。所以，

2、尋找新的前列腺癌診斷標(biāo)志物，建立更加特異的診斷方法，是目前對(duì)前列腺癌診斷研究的熱點(diǎn)。
　　DD3基因是近年來(lái)所發(fā)現(xiàn)的一種前列腺癌特異基因。DD3mRNA既能高表達(dá)于癌性前列腺上皮細(xì)胞株中(>95％)，而且在前列腺癌發(fā)生時(shí)表達(dá)量明顯升高，其診斷敏感性和特異性大于90％，目前被認(rèn)為是一個(gè)具有臨床應(yīng)用潛力的前列腺癌標(biāo)志物。進(jìn)一步探明DD3基因在前列腺癌診斷、治療、預(yù)后評(píng)估等方面應(yīng)用將具有重要意義。
　　本研究首先克隆了DD3基因片

3、段，即根據(jù)外顯子4設(shè)計(jì)一對(duì)引物，自L(fǎng)NCaP細(xì)胞中提取總RNA，以L(fǎng)NCaP細(xì)胞cDNA作模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳純化后與PMD18-T載體連接，再將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行克?。惶崛≈亟M質(zhì)粒在紫外分光光度計(jì)上定量，作為定量檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)品。結(jié)果經(jīng)重組質(zhì)粒PCR擴(kuò)增及序列測(cè)定，表明PMD18-T-DD3cDNA克隆成功，可作為前列腺癌熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法的標(biāo)準(zhǔn)品并可應(yīng)用于定量標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制，為前列腺癌DD3

4、特異性基因熒光定量PCR方法的建立提供保證。
　　本研究在完成DD3mRNA重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品建立的基礎(chǔ)上，建立了實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)前列腺癌特異性DD3mRNA方法。經(jīng)方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果證實(shí)，其最低檢測(cè)限為1.64×101拷貝/ml，線(xiàn)性范圍為1.64×101～1.64×1011拷貝/ml，證明具有良好的敏感性；經(jīng)對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物純化后，直接測(cè)序分析并進(jìn)行Blast同源性比較，證實(shí)有較好的特異性；同時(shí)經(jīng)檢測(cè)具有良好的穩(wěn)定性和重復(fù)性。

5、　　我們針對(duì)27例前列腺癌組進(jìn)行DD3mRNA檢測(cè)發(fā)現(xiàn)其陽(yáng)性例數(shù)顯著高于非前列腺癌組和健康對(duì)照組，其中全血標(biāo)本陽(yáng)性例數(shù)為18(18)、尿液標(biāo)本陽(yáng)性例數(shù)為4(5)、前列腺液標(biāo)本陽(yáng)性例數(shù)為4(4)；而在30份非前列腺癌患者標(biāo)本中只有1份前列腺液出現(xiàn)低拷貝值1.984log拷貝數(shù)/ml，其原因有待進(jìn)一步觀察確定；30份健康人標(biāo)本均為陰性。對(duì)前列腺癌進(jìn)行病理分級(jí)后并觀測(cè)與DD3cDNA拷貝數(shù)的變化，結(jié)果DD3cDNA拷貝數(shù)隨病理分級(jí)的增加而增高

6、。
　　對(duì)全血DD3mRNA檢測(cè)與血清PSA的檢測(cè)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果在18例前列腺癌全血標(biāo)本中發(fā)現(xiàn)DD3mRNA陽(yáng)性例數(shù)為18，而PSA陽(yáng)性例數(shù)為16；在20例非前列腺癌全血標(biāo)本和10例健康全血對(duì)照標(biāo)本中DD3mRNA均為陰性；PSA在非前列腺癌組出現(xiàn)4例陽(yáng)性，經(jīng)對(duì)4例PSA陽(yáng)性患者的臨床病理結(jié)果調(diào)查，均不是前列腺癌。結(jié)果證明全血DD3mRNA檢測(cè)在特異性上優(yōu)于PSA。在測(cè)定PSAmRNA定量的基礎(chǔ)上，我們引入DD3得分概念，即將DD