白紋伊蚊唾液腺aegyptin相似蛋白(alALP)的重組表達和功能研究.pdf

1、蚊能傳播多種疾病，嚴重危害人類健康。蚊唾液腺中存在多種功能蛋白，如抗凝劑、抗炎劑和免疫流行病學分子靶標等。雖然，已有報道蚊唾液腺30KD的蛋白組分是主要的分泌蛋白，具有很強的抗原性，但是其單個成員的蛋白抗原性及是否具有其它生物學活性尚不清楚。最近報道了其成員之一的埃及伊蚊(Aedesaegypti)aegyptin蛋白具有抗凝血活性，能特異性阻斷血小板和膠原蛋白的結合。本文通過生物信息學分析發(fā)現，白紋伊蚊（aedes albopictu

2、s）30KD蛋白家族的一個成員與aegyptin蛋白高度同源，命名為白紋伊蚊唾液腺aegyptin相似蛋白（A.albopictus aegyptin-like protein，alALP），并構建表達載體，制備了重組alALP，初步分析了其抗原性及抗凝血活性。
　　目的：
　　構建alALP的原核表達系統和真核表達系統，制備重組alALP融合蛋白，分析其抗原性和抗凝血活性，探討alALP作為暴露蚊叮咬免疫流行病學分子靶標和

3、抗凝血活性藥物的可行性。
　　方法：
　　1.生物信息學分析。運用生物信息學方法分析蚊唾液腺30KD蛋白家族的系統發(fā)育樹，分析alALP與aegyptin蛋白的同源性、二級結構、親水性和抗原肽段，分析alALP蛋白的信號肽和成熟肽。
　　2.alALP基因的克隆。提取白紋伊蚊唾液腺總RNA，根據alALP的基因編碼序列(Genbank: AAV90693.1)設計引物，RT-PCR擴增alALP的成熟肽基因，亞克隆至p

4、MD19-T載體，測序驗證。
　　3.alALP的原核表達和抗原性分析。擴增alALP的成熟肽基因，克隆到E.ColiBL21原核表達載體(pGEX-6P-1)，經IPTG誘導表達。利用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)和蛋白質印跡(Western blotting)分析重組融合蛋白GST-alALP的表達情況。利用谷胱甘肽瓊脂糖4B和超濾器純化濃縮GST-alALP，皮下注射免疫ICR小鼠3次，每次免疫劑量60μg，

5、制備小鼠抗GST-alALP血清。分別以小鼠抗GST-alALP血清和白紋伊蚊叮咬后小鼠血清為一抗，Westernblotting分析GST-alALP的抗原性。
　　4.alALP的真核表達和抗凝血活性分析。根據畢赤酵母密碼子偏好，優(yōu)化合成alALP的成熟肽基因，克隆到畢赤酵母X33真核表達載體(pPICZαA)中進行表達。利用SDS-PAGE和Western blotting分析重組融合蛋白ralALP的表達情況。ralALP

6、經鎳螯合親和層析柱純化、透析袋換液和超濾器濃縮，手動法檢測其對凝血酶時間(TT)、凝血酶原時間(PT)和活化部分凝血活酶時間(APTT)的影響，以分析alALP的抗凝血活性。
　　結果：
　　本文構建了蚊唾液腺30KD蛋白家族的系統發(fā)育樹;比對分析了alALP與aegyptin等蛋白的同源性;成功構建了alALP的原核和真核表達系統;初步分析了alALP的抗原性和抗凝血活性，得出了如下主要結果和結論:
　　(1)蚊唾液

7、腺30KD蛋白家族在進化上保守，而alALP較AAPP和GE rich蛋白與aegyptin更接近;alALP與aegyptin的蛋白序列具有65.58％的一致性，它們的羧基端十分保守，它們具有相同的信號肽、相似的親水性和一段保守的抗原肽段;alALP、aegyptin、AAPP和GE_rich蛋白的羧基端保守，它們的二級結構具有相同的折疊域。這些結果預示，alALP可能具有aegyptin相似的生物學活性。
　　(2)成功擴增到

8、目的alALP基因并將其克隆到了pMD19-T載體中，經測序證實該DNA片段就是目的alALP基因。
　　(3)成功構建了高表達的alALP原核表達系統。在37℃、1mmol/LIPTG誘導6～8 h，重組融合蛋白GST-alALP表達量高且無降解，主要以可溶性蛋白形式表達。GST-alALP具有很強的抗原性，免疫小鼠能誘導產生特異性抗體，且能被白紋伊蚊叮咬后的小鼠血清識別。這些結果說明，alALP具有進一步作為暴露蚊叮咬的免疫流

9、行病學分子標志物的研究意義。
　　(4)成功構建了高表達的alALP真核表達系統。在30℃、1％甲醇誘導48 h，重組蛋白ralALP表達量高且無降解，可以被正常分泌到細胞外。ralALP具有抗凝血活性，能顯著延長凝血酶時間(TT)、凝血酶原時間(PT)和活化部分凝血活酶時間(APTT)。alALP的抗凝血機制是否和aegyptin一樣特異性阻斷血小板和膠原蛋白的結合，還無法確定。這些結果表明，alALP具有進一步開發(fā)為抗凝血活性