雷帕霉素對HL-60細胞內(nèi)PI3K-Akt-mTOR通路下游蛋白表達的影響.pdf

1、目的:急性早幼粒細胞白血病(acute promyelocytic leukemia，APL)是一種血液系統(tǒng)的惡性疾病，起源于造血干細胞克隆性異常增殖，是急性髓系白血病中的一種特殊類型，其中15號染色體的PML基因和17號染色體RARa基因易位，形成特征性細胞遺傳學異常t(15;17)(q22，q21)，出現(xiàn)PML-RARa(promyelocytic leukemia/retinoic acid receptor alpha)融合基因

2、。并證明了早幼粒細胞白血病/維甲酸受體融合基因是急性早幼粒細胞白血病發(fā)病的分子基礎，該融合基因編碼的融合蛋白具備一定的酪氨酸激酶活性，細胞內(nèi)相關信號通路可被進一步異常激活，從而具有促進細胞異常增殖及使細胞內(nèi)產(chǎn)生抗凋亡特性[1-4]。目前急性早幼粒細胞白血病在臨床上基本是可以治愈的疾病，其是應用維甲酸(ATRA)和亞砷酸(ATO)來誘導分化治療，可以取得80％-90％的完全緩解率，但是維甲酸的應用易發(fā)生維甲酸綜合征，長期應用可發(fā)生耐藥，并

3、且部分復雜和難治性患者不能誘導緩解或緩解后易復發(fā)。
　　雷帕霉素(Rapamycin，RAPA)屬于大環(huán)內(nèi)酯類，本質(zhì)是一種抗生素，為mTOR通路抑制劑。雷帕霉素作為免疫抑制劑，通過阻斷信號轉導來抑制免疫細胞的生長和增殖，抑制IL-2及其他免疫分子的合成來發(fā)揮免疫抑制作用，同時抑制移植患者IgG的產(chǎn)生和供著特異性免疫的發(fā)生[5-7]。因其具有強的免疫抑制已被FDA批準用于器官移植的抗排斥反應。相對于傳統(tǒng)的免疫抑制劑，雷帕霉素具有用量

4、小，效率高，毒副作用小尤其是腎毒性小。其在風濕免疫系統(tǒng)性疾病、器官移植術后降低免疫排斥反應以及對腎臟功能的修復等多類疾病治療中均具有顯著的效果。研究顯示雷帕霉素不僅具有免疫抑制作用，還具有抗腫瘤的雙重作用。其主要是通過抑制mTOR信號通路來抑制細胞內(nèi)周期的轉換，抑制細胞內(nèi)DNA的復制，使細胞不能進行正常的有絲分裂，雷帕霉素可誘導腫瘤細胞凋亡、抑制新生血管生成、腫瘤侵襲和抑制血管內(nèi)皮增殖來發(fā)揮其抗腫瘤作用[8-13]，而且在實驗研究中得到

5、證實。目前，在臨床上雷帕霉素已經(jīng)應用于某些實體腫瘤的治療，并且取得一定的療效，實驗證實雷帕霉素主要是通過抑制mTOR信號通路發(fā)揮作用，目前越來越多研究白血病的發(fā)生與信號通路的過度激活有關，因此雷帕霉素在治療造血系統(tǒng)惡性腫瘤方面的作用也正在被越來越多的人關注和研究。
　　目前在臨床上，維甲酸和三氧化二砷成為治療急性早幼粒細胞白血病一線藥物，治療效果顯著，但仍存在一些問題，部分患者發(fā)生耐藥的情況也越來越明顯。PML-RARa融合蛋白的

6、形成是急性早幼粒細胞白血病的發(fā)病基礎，具有一定的酪氨酸激酶活性，從而使細胞分化發(fā)生阻滯，進而導致疾病的發(fā)生。因此靶向降解該融合蛋白，恢復原有基因的功能，使阻滯細胞分化成熟，這是治療藥物機制。但是，一旦患者出現(xiàn)過度增強的酪氨酸激酶活性，出現(xiàn)多藥耐藥基因的過度表達，白血病細胞的抗凋亡能力就會提高，降低了患者對化療藥物的反應，從而患者發(fā)生耐藥。多項研究表明患者出現(xiàn)耐藥很可能是多種發(fā)生機制的聯(lián)合結果，整體過程復雜，其具體機制需要進一步研究。針對

7、耐藥的急性早幼粒細胞白血病患者，我們可以嘗試研究其他新的化療藥物，為復發(fā)難治患者的治療帶來新的希望。現(xiàn)在多項研究表明急性早幼粒細胞白血病中的磷脂酰肌醇3激酶(phosp-hatidylinositol3 kinase，PI3K)/蛋白激酶B(Akt)/雷帕霉素靶蛋白(targetof rapamycin，mTOR)信號通路存在異常激活，在腫瘤細胞的增殖、凋亡、分化和耐藥性上起重要作用。本實驗是在長期研究白血病中信號轉導作用機制的基礎上，

8、探討mTOR信號通路抑制劑雷帕霉素是否通過抑制mTOR靶點的活性來抑制早幼粒細胞白血病細胞株的生長，探究其作用于急性早幼粒細胞白血病細胞株HL-60細胞后，對其生長增殖，凋亡和該通路下游基因與蛋白表達的生物學影響，為臨床上急性早幼粒細胞白血病的治療探索新的方法和策略。
　　方法:
　　1、MTT方法檢測不同濃度的雷帕霉素對HL-60細胞增殖的影響。
　　2、NADH細胞染色方法檢測不同濃度的雷帕霉素對HL-60細胞內(nèi)線

9、粒體的影響，間接反應細胞凋亡情況。
　　3、RT-PCR檢測不同濃度雷帕霉素對HL-60細胞PI3K/Akt/mTOR通路下游mRNA的影響。
　　4、Western Blot法檢測不同濃度的雷帕霉素對HL-60細胞PI3K/Akt/ mTOR通路下游蛋白水平上表達的影響。
　　5、統(tǒng)計學方法處理。
　　結果:
　　1、不同濃度的雷帕霉素對HL-60細胞增殖情況的影響
　　用不同濃度的雷帕霉素作用于對

10、數(shù)期的HL-60細胞，24h后，應用MTT方法（CCK-8試劑處理）檢測，結果發(fā)現(xiàn)雷帕霉素能夠抑制HL-60細胞的增殖，20、40、80、160、320、640 nmol/L雷帕霉素處理組HL-60細胞的抑制率均明顯高于空白對照組(P＜0.05)，并且呈濃度依賴性。在此濃度范圍內(nèi)，隨著雷帕霉素濃度的升高，HL-60細胞存活率會逐漸降低。而5nmol/L、10nmol/L、20nmol/L濃度雷帕霉素作用組對HL-60細胞存活率無顯著影響

11、（P＞0.05），分析后IC50為211.9nmol/L。
　　2、不同濃度的雷帕霉素對HL-60細胞內(nèi)線粒體的影響
　　用不同濃度的雷帕霉素作用于HL-60細胞24h后，通過NADH細胞染色后發(fā)現(xiàn)，40、80nmol/L處理組HL-60細胞與空白對照組相比，細胞整體成團趨勢減小，細胞內(nèi)線粒體由月牙形變?yōu)槌蓤F塊或斑塊分布，局部顆粒變淺，且胞膜及核膜由開始的光滑完整出現(xiàn)皺縮裂口，甚至出現(xiàn)細胞的崩解，并且隨濃度的增高，這些現(xiàn)象越

12、明顯。
　　3、雷帕霉素對HL-60細胞內(nèi)PI3K/Akt/mTOR下游因子mRNA表達的影響
　　用不同濃度的雷帕霉素，40nmol/L，80nmol/L，160nmol/L處理HL-60細胞24小時后，應用實時熒光定量PCR處理后結果表明，翻譯起始因子e1F4E結合蛋白1(4E-BP1)，核糖體40S小亞基S6K蛋白激酶P70S6K，血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)，缺氧誘導因子-a(HIF-a)基因表達水平均明顯低于空白對

13、照組基因的表達量(P＜0.05)，而且呈濃度依耐性，隨著雷帕霉素濃度增高，mRNA表達量逐漸降低(P＜0.05)。
　　4、雷帕霉素對HL-60細胞內(nèi)PI3K/Akt/mTOR下游因子蛋白的影響
　　用不同濃度雷帕霉素處理HL-60細胞24小時后，濃度分別為40nmol/L，80nmol/L，160nmol/L。Western blot實驗結果顯示，藥物處理組與空白對照組相比HL-60細胞內(nèi)mTOR下游因子4E-BP1，VE

14、GF, HIF-a蛋白表達降低(P＜0.05)，而且藥物處理組隨著雷帕霉素濃度的增加，相關蛋白的表達量逐漸降低(P＜0.05)。
　　結論
　　1、在一定濃度范圍內(nèi)，雷帕霉素可有效提高對HL-60細胞的抑制率，并且呈濃度依賴性，濃度越高，抑制細胞增殖的能力越強。同時，雷帕霉素在一定濃度范圍內(nèi)可以減少線粒體的數(shù)量及影響其質(zhì)量，使細胞崩解，促進HL-60細胞的凋亡。
　　2、雷帕霉素在一定濃度范圍內(nèi)能夠使HL-60細胞內(nèi)P