麻黃—石膏藥對(duì)配伍的化學(xué)成分、藥效及代謝組學(xué)研究.pdf

1、藥對(duì)又稱“對(duì)藥”、“對(duì)子藥”、“姐妹藥”，由兩味藥成對(duì)，個(gè)別由三味以上藥組成，是臨床上常用的相對(duì)固定的配伍形式。藥對(duì)的配伍是中藥復(fù)方配伍的最簡(jiǎn)單、最基本和最常見的形式，其以一定證候特點(diǎn)及采用相應(yīng)治法為前提，根據(jù)藥物的性味歸經(jīng)、升降浮沉，選擇性地將兩味中藥進(jìn)行配對(duì)，其配伍蘊(yùn)涵著豐富的客觀規(guī)律。
　　 本課題為麻黃類藥對(duì)組成規(guī)律的基礎(chǔ)研究（國(guó)家自然基金重點(diǎn)項(xiàng)目）的部分研究?jī)?nèi)容。麻黃-石膏藥對(duì)是中醫(yī)臨床常用的藥對(duì)之一，在很多經(jīng)典方劑中

2、都有運(yùn)用，例如麻杏石甘湯、越婢湯等，現(xiàn)代常用于感冒、支氣管肺炎、支氣管哮喘等屬表邪未盡，熱邪壅肺等證。本課題選擇經(jīng)方麻杏石甘湯及其“主藥對(duì)”麻黃-石膏藥對(duì)為研究對(duì)象，以2味藥的配比量為切入點(diǎn)，將麻黃-石膏藥對(duì)的配伍研究分解為1）藥對(duì)配伍前后的體外化學(xué)成分變化研究;2）主要藥理效應(yīng)（毒性）比較研究;3）藥對(duì)配伍對(duì)對(duì)代謝組生物信息的干預(yù)研究;4）綜合分析麻黃-石膏藥對(duì)配伍、化學(xué)成分變化與藥理效應(yīng)改變?nèi)唛g的相互關(guān)系。
　　 研究目的

3、：
　　 本研究以經(jīng)典的寒熱配伍藥對(duì)麻黃-石膏為研究對(duì)象，運(yùn)用現(xiàn)代技術(shù)手段，從化學(xué)成分變化、量效關(guān)系、藥理效應(yīng)改變、體內(nèi)代謝途徑與機(jī)制等方面對(duì)麻黃-石膏藥對(duì)進(jìn)行較為全面和系統(tǒng)的研究，通過分析麻黃-石膏藥對(duì)不同比例配伍中指標(biāo)性成分的含量、藥效作用及代謝組學(xué)等方面的差異，可以尋求其發(fā)揮作用的最佳配伍比例，找出其量效、時(shí)效以及毒效間的關(guān)系，從而有利于更好地發(fā)揮藥物的療效，并可進(jìn)一步驗(yàn)證、深化麻黃-石膏藥對(duì)“相使”的配伍關(guān)系，據(jù)此為麻黃

4、-石膏藥對(duì)配伍的制劑研究及其臨床應(yīng)用，提供工作基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 研究方法：
　　 《傷寒論》中麻杏石甘湯組成為:“麻黃四兩（去節(jié)）;杏仁五十個(gè)，去皮尖;甘草二兩，炙;石膏半斤。本實(shí)驗(yàn)選取麻杏石甘湯中的藥對(duì)麻黃—石膏(1∶2)為研究對(duì)象，依據(jù)藥對(duì)文獻(xiàn)報(bào)道的配比上下成倍浮動(dòng)，設(shè)計(jì)成三個(gè)配比1∶1、1∶2、1∶4三個(gè)配伍組。
　　 1.麻黃-石膏藥對(duì)不同配伍配比的體外化學(xué)成分研究
　　 建立測(cè)定麻黃-石膏

5、水煎液中麻黃類生物堿的HPLC方法并進(jìn)行了精密度、穩(wěn)定性、加樣回收率等方法學(xué)考察;采用HPLC測(cè)定麻黃、麻黃石膏藥對(duì)1∶1、1∶2、1∶4三個(gè)配伍配比水煎液中麻黃類生物堿（去甲基麻黃堿、去甲基偽麻黃堿、麻黃堿、偽麻黃堿和偽麻黃堿）的含量并比較麻黃-石膏不同比例配伍前后水煎液中5種生物堿含量的變化。
　　 利用鈣離子試劑盒測(cè)定各組水煎液中的鈣離子并比較了麻黃-石膏不同比例配伍對(duì)Ca2+溶出的影響。
　　 采用反相高效液相色

6、譜法，選用Cosmosil C18柱(250mm×4.6mm，5μm)，流動(dòng)相為乙腈-0.1％磷酸水溶液（含0.1％三乙胺）進(jìn)行梯度洗脫，分析并確定了麻黃-石膏不同比例配伍水煎液的“共有峰”，并研究了不同比例配伍對(duì)“共有峰”的影響。
　　 2.麻黃石膏藥對(duì)不同比例配伍的主要藥理效應(yīng)研究
　　 急性毒性研究昆明小鼠，雌雄各半，分為麻黃、麻黃-石膏(1∶1)、麻黃-石膏(1∶2)、麻黃-石膏(1∶4)5個(gè)給藥組，每組分別設(shè)5

7、個(gè)劑量組(n=10)，根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定的Dn、Dm，定出相鄰兩組劑量比，組間比值為1∶0.8。實(shí)驗(yàn)時(shí)將依據(jù)“低比稀釋法”配制不同濃度的藥液灌胃給予相應(yīng)的小鼠。灌胃前禁食不禁水12小時(shí)，灌胃后觀察飼養(yǎng)7d，觀察小鼠的精神、活動(dòng)、飲食、大小便、死亡等情況。記錄各組動(dòng)物中毒癥狀及死亡情況。記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果，并用Bliss軟件計(jì)算LD50值和95％置信區(qū)間。
　　 解熱作用研究采用干酵母混懸液誘導(dǎo)雄性SD大鼠發(fā)熱模型，選取體溫合格大鼠，隨機(jī)分

8、為隨機(jī)分為19組，即空白對(duì)照組、模型對(duì)照組、阿司匹林組、麻黃高中低劑量組、石膏高中低組、麻杏石甘湯組、麻黃石膏(1∶1)高中低低劑量組、麻黃石膏(1∶2)高中低劑量組、麻黃石膏(1∶4)高中低組，每組6只，灌胃給藥（正常對(duì)照組和模型對(duì)照組均給予等容積蒸餾水），給藥后每小時(shí)測(cè)量肛溫一次，連續(xù)測(cè)量三次。計(jì)算各給藥組8h對(duì)大鼠體溫升高抑制率(％)。利用Calcusyn統(tǒng)計(jì)軟件(Biosoft，USA)分析麻黃-石膏兩者的相互作用。
　　

9、 平喘作用研究采用卵蛋白誘導(dǎo)的哮喘大鼠模型，將60只SD大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型組、地塞米松組、麻石1∶2（高、中、低）劑量組、麻黃-石膏(1∶1)組和麻黃-石膏（1∶4，單味麻黃組、石膏組共10組，每組6只。觀察麻黃、石膏配伍前后對(duì)大鼠引喘潛伏期、肺干濕重、EOS、WBC計(jì)數(shù)影響。
　　 3.麻黃石膏藥對(duì)不同配伍干預(yù)干酵母誘導(dǎo)熱病癥候的代謝組學(xué)研究
　　 “發(fā)熱”大鼠模型的建立及其代謝組學(xué)研究將12只雄性Wist

10、ar大鼠隨機(jī)分為2組(n=6)，空白對(duì)照組和模型組（背部皮下注射20％酵母混懸液10mL·kg-造模），將大鼠（正常對(duì)照組，模型組）置于代謝籠中收集6h尿液，尿液直接衍生化。采用G C-MS聯(lián)用技術(shù)測(cè)定各組大鼠尿液代謝物譜。運(yùn)用XCMS工具箱對(duì)代謝物譜進(jìn)行峰識(shí)別、峰對(duì)齊和去噪等處理，得到由保留時(shí)間、樣品號(hào)及信號(hào)強(qiáng)度組成的三維矩陣，將矩陣導(dǎo)入模式識(shí)別軟件Simca-P12.0(瑞典，Umetrics AB，Umea)進(jìn)行主成分分析(PCA

11、)、偏最小二乘法判別分析(PLS-DA)。PLS-DA的結(jié)果中列出各變量的變量重要性值VIP(Variable Importance in the Projection)，根據(jù)VIP大小排列，其中VIP值大于1的變量被認(rèn)為是變化明顯且對(duì)區(qū)分貢獻(xiàn)較大，作為標(biāo)記物分析，通過與氣質(zhì)工作站的數(shù)據(jù)庫(kù)、對(duì)照品及查詢網(wǎng)站進(jìn)行對(duì)比分析，選擇匹配度較高的內(nèi)源性生物標(biāo)志物作為鑒定結(jié)果。
　　 麻黃-石膏對(duì)“發(fā)熱”大鼠的代謝組學(xué)研究將雄性Wistar

12、大鼠隨機(jī)分為5組，即空白對(duì)照組、模型組、麻黃組、麻黃石膏1∶2組和石膏組，每組6只。除空白組外，大鼠背部皮下注射20％干酵母（10mL/kg大鼠體重）造模，各給藥組分別在造模后6 h灌胃給藥一次，收集給藥后6 h尿液，對(duì)空白組、模型組、麻黃組、麻黃石膏1∶2組和石膏組的尿液代謝輪廓進(jìn)行主成分分析(PCA)和PLS-DA分析，對(duì)其特征抽提及模式識(shí)別。選擇VIP值大于1的物質(zhì)作為干酵母誘導(dǎo)發(fā)熱模型的潛在特異性生物標(biāo)志物，通過與氣質(zhì)工作站的數(shù)

13、據(jù)庫(kù)、對(duì)照品及查詢網(wǎng)站進(jìn)行對(duì)比分析，選擇匹配度較高的內(nèi)源性生物標(biāo)志物作為鑒定結(jié)果。分析麻黃組、麻黃石膏1∶2組和石膏組生物標(biāo)志物的差異及水平變化，結(jié)合現(xiàn)有的生物化學(xué)知識(shí)闡釋麻黃、石膏藥對(duì)配伍前后的調(diào)節(jié)機(jī)制。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　 1.麻黃石膏藥對(duì)不同比例配伍的體外化學(xué)成分研究
　　 麻黃-石膏藥對(duì)不同比例配伍對(duì)麻黃類生物堿含量的影響水煎液中5種生物堿（去甲基偽麻黃堿、去甲基麻黃堿、麻黃堿、偽麻黃堿和偽麻黃堿）含

14、量的變化實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，除麻黃-石膏(1∶4)配伍組中的去甲基麻黃堿含量比單味麻黃組降低(P＜0.05)，麻黃-石膏(1∶1)和麻黃-石膏(1∶2)配伍組各生物堿含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。麻黃-石膏(1∶1)、麻黃-石膏(1∶2)、麻黃-石膏(1∶4)三個(gè)配伍組的水煎液中，麻黃-石膏(1∶2)的總生物堿含量最高。
　　 麻黃-石膏藥對(duì)不同比例配伍對(duì)鈣離子含量的影響利用析因分析麻黃、石膏不同比例配伍對(duì)Ca2+溶出量的影響∶麻黃-石膏(1

15、∶1)組之間交互作用顯著(F=22.222，P=0.002)，通過比較發(fā)現(xiàn)，配伍后Ca2+溶出量則低于麻黃和石膏單煎所得Ca2+總量的加和，二者的差異具有顯著性意義，說明麻黃-石膏(1∶1)配伍組會(huì)抑制Ca2+的溶出?？梢哉J(rèn)為麻黃-石膏(1∶1)二者之間有拮抗作用。麻黃-石膏(1∶2)組之間交互作用顯著(F=21.144，P=0.002)，通過含量比較發(fā)現(xiàn)，配伍后Ca2+溶出量則低于麻黃和石膏單煎所得Ca2+總量的加和，二者的差異具有顯

16、著性意義，說明麻黃-石膏(1∶2)配伍組會(huì)抑制Ca2+的溶出。麻黃-石膏(1∶4)組之間交互作用顯著(F=95.617，P=0.000)，通過含量比較發(fā)現(xiàn)，配伍后Ca2+溶出量則低于麻黃和石膏單煎所得Ca2+總量的加和，二者的差異具有顯著性意義，說明麻黃-石膏(1∶4)配伍組會(huì)抑制Ca2+的溶出。
　　 麻黃-石膏不同比例配伍對(duì)水煎液“共有峰”的影響不同比例麻黃-石膏的合煎液，其化學(xué)成分變化較為復(fù)雜，配伍比例不同，10個(gè)共有峰的

17、情況變化也不相同。有的峰峰面積增大，有的降低，有的峰面積基本不保持不變。
　　 2.麻黃石膏藥對(duì)不同比例配伍的主要藥理效應(yīng)研究
　　 急性毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果各比例配伍組中，在能夠引起試驗(yàn)動(dòng)物一半死亡的藥物劑量下，麻黃所占的比例及其可信區(qū)間分別為單味麻黃131.67(108.23～166.81)g·kg-1，麻黃石膏(1∶1)113.22(96.32～153.82) g·kg-1，麻黃石膏(1∶2)124.15(107.48～1

18、47.38) g·kg-1，麻黃石膏(1∶4)106.05(89.14～134.02) g·kg-1。由表可知，麻黃的LD50值從大到小的順序依次:麻黃≌麻黃石膏(1∶2)＞麻黃石膏(1∶1)＞麻黃石膏(1∶4)。
　　 解熱實(shí)驗(yàn)結(jié)果與模型組相比，麻黃組、麻黃石膏(1∶1)組、麻黃石膏(1∶2)組、麻黃石膏(1∶4)組均具有解熱作用，且呈一定的量-效關(guān)系。各給藥組8h抑制率(％)從大到小排列為:麻石1∶2高劑量組(62.7)、麻

19、杏石甘湯全方組(59.7)、麻黃高劑量組(59.0)、麻石1∶2中劑量組(53.6)、麻黃中劑量組(49.4)、麻石1∶1高劑量組(47.7)、麻石1∶4高劑量組(47.2)、麻石1∶1中劑量組(43.1)、麻石1∶4中劑量組(37.1)、石膏高劑量(33.0)、麻石1∶1低劑量組(30.8)、麻石1∶4低劑量組(28.4)、麻石1∶2低劑量組(21.7)、麻黃低劑量組(21.6)、石膏中劑量(10.9)、石膏低劑量(4.6)。通過比較

20、麻黃石膏藥對(duì)3個(gè)配比解熱的作用時(shí)間與作用強(qiáng)度，我們發(fā)現(xiàn)麻黃石膏(1∶2)的解熱作用最佳，解熱持續(xù)時(shí)間最長(zhǎng)。麻黃-石膏(1∶2)在解熱方面具有協(xié)同增效作用。
　　 平喘作用結(jié)果麻石1∶2高、中劑量組均能延長(zhǎng)引喘潛伏期(P＜0.01)，麻石1∶2配伍組作用效果優(yōu)于麻石1∶1、麻石1∶2組、單味麻黃、單味石膏組;麻石1∶2高、中劑量組、單味麻黃組均能減少EOS數(shù)量(p＜0.01);麻石1∶2高劑量組和麻石1∶4組組均能減少WBC數(shù)量(

21、p＜0.01);麻石1∶2組高、中、低劑量、麻黃組、石膏組和麻石1∶4組均能降低肺干濕重比值(p＜0.01);通過引喘潛伏期、肺干濕重比值、EOS和WBC計(jì)數(shù)綜合分析比較，我們發(fā)現(xiàn)麻黃石膏(1∶2)的平喘作用最佳，麻黃-石膏(1∶2)其合用的效果優(yōu)于同等劑量下的單味麻黃或石膏。
　　 3.麻黃石膏藥對(duì)不同比例配伍干預(yù)“發(fā)熱”大鼠尿液代謝組學(xué)研究
　　 “發(fā)熱”大鼠模型的建立及其代謝組學(xué)研究通過對(duì)模型組和空白組大鼠尿液代謝

22、物組進(jìn)行PCA分析，兩組大鼠的尿液樣本可以在PCA的得分圖上較為明顯的區(qū)分開來，提示干酵母誘導(dǎo)的“發(fā)熱”模型成功，大鼠機(jī)體代謝網(wǎng)絡(luò)發(fā)生了明顯的變化。為進(jìn)一步關(guān)注干酵母引起的尿液代謝差異，找到與干酵母誘導(dǎo)發(fā)熱相關(guān)的代謝通道的變化，實(shí)驗(yàn)采用PLS-DA法對(duì)模型組大鼠和正常組大鼠樣本重新建模，用以鑒別造成上述分離的差異變量。結(jié)果顯示，模型組和正常組在PC1上明顯分離，并且該模型有較高的解釋率和預(yù)測(cè)率(R2Xcum=0.878，R2Ycum=0

23、.993，Q2Ycum=0.969)。通過上述PLS-DA法對(duì)兩組大鼠樣本重新建模后，根據(jù)S-Plot圖(圖4-6A)中離子的置信度和VIP值可知離子對(duì)分類貢獻(xiàn)的大小，找到VIP值大于1的與干酵母誘導(dǎo)發(fā)熱高度相關(guān)的代謝物(圖4-6B)，運(yùn)用氣質(zhì)工作站的數(shù)據(jù)庫(kù)（WILEY275.L及NIST05.L），結(jié)合自建的對(duì)照品物質(zhì)庫(kù)及查詢網(wǎng)站(http://www.hmdb.ca/和http://metlin.scripps.edu/metabo

24、 searchalt2.php)查找差異變量。分析結(jié)果顯示，模型組和對(duì)照組共有10個(gè)物質(zhì)有顯著性差異，分別是:檸檬酸、酮戊二酸、3-丙酸、苯乙酸、甘氨酸、正丁胺、碳酸、丙氨酸、苯丙酮酸、苯甲酸。
　　 麻黃、石膏及其合煎液對(duì)“發(fā)熱”大鼠的代謝組學(xué)研究結(jié)果通過對(duì)空白組、模型組、麻黃組、麻黃桂枝組、石膏組大鼠尿液代謝物組進(jìn)行PCA分析，5組大鼠的尿液樣本可以在PCA的得分圖上較為明顯的區(qū)分開來，說明來大鼠給予不同處理后，其代謝物譜差

25、異明顯。不同處理組的樣品之間的細(xì)微差異可以通過PLS-DA進(jìn)行分析研究。
　　 麻黃組和模型組相比，麻黃組中丙二酸、苯甲酸、丁二酸、丙氨酸、甘氨酸、纈氨酸、脯檬酸、辛二酸、尿素、馬尿酸、苯丙酸、苯丙氨酸、2-羥基喹啉-羧酸含量升高(P＜0.05)。
　　 石膏處理組和模型組相比，石膏中苯甲酸、丁二酸、丙氨酸、3-丙酸、脯氨酸、辛二酸、L-谷氨酸含量升高(P＜0.05)。
　　 麻黃-石膏組與模型組相比，麻黃-石膏

26、組中丙二酸、苯甲酸、丁二酸、甘氨酸、3-丙酸、脯氨酸、辛二酸、尿素、馬尿酸、苯丙酸、苯丙氨酸、半胱氨酸含量升高（P＜0.05）。
　　 麻黃-石膏組與單味石膏相比，丙二酸、苯甲酸、甘氨酸、異亮氨酸、馬尿酸、苯丙酸、1-脯氨酸含量升高(P＜0.05)。
　　 石膏組與單味麻黃相比，麻黃組中丙二酸、苯甲酸、丁二酸、3-丙酸、琥珀酸、尿素、馬尿酸、苯丙酸、1-脯氨酸含量升高(P＜0.05)。
　　 對(duì)以上這些代謝物含量

27、用單變量方差分析方法進(jìn)行檢驗(yàn)，其結(jié)果與PLS-DA的分析結(jié)果基本一致。
　　 結(jié)論:
　　 通過對(duì)麻黃-石膏“藥對(duì)”進(jìn)行化學(xué)成分、藥效及代謝組學(xué)三方面的研究，確定麻黃與石膏配伍應(yīng)用后，麻黃-石膏(1∶2)配伍比例組在解熱、平喘方面優(yōu)于麻黃-石膏(1∶1)、麻黃-石膏(1∶4)配伍組，該最優(yōu)比例與原方麻杏石甘湯中麻黃-石膏1∶2相一致，從化學(xué)成分的角度，發(fā)現(xiàn)其增效的物質(zhì)基礎(chǔ)與增加其有效成分的含量（總生物堿以及Ca2+的溶出