泛素-蛋白酶體途徑在TRAIL誘導(dǎo)惡性淋巴瘤凋亡抵抗中的作用.pdf

1、目的:惡性淋巴瘤發(fā)病率居我國(guó)惡性腫瘤第八位,平均死亡年齡49.9歲,是嚴(yán)重危及兒童和青少年的惡性腫瘤。目前化療是治療惡性淋巴瘤的主要手段之一,因此如何篩選出有效的化療藥物,并且提高敏感性、克服耐藥性是當(dāng)前急需解決的問題。
　　 TRAIL(TNF-related apoptosis-inducing ligand)是近年發(fā)現(xiàn)的具有選擇性誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞,轉(zhuǎn)化細(xì)胞和病毒感染細(xì)胞凋亡而對(duì)正常細(xì)胞沒有毒性的腫瘤壞死因子家族成員。在Ⅰ型細(xì)胞

2、,活化的procaspase-8和procaspase-10通常直接觸發(fā)caspase依賴的凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。但在Ⅱ型細(xì)胞,需要通過線粒體依賴的信號(hào)傳導(dǎo)途徑而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。目前研究表明TRAIL可以誘導(dǎo)許多惡性腫瘤細(xì)胞凋亡,但幾乎不引起正常細(xì)胞凋亡,因此TRAIL被認(rèn)為是一種有希望的惡性腫瘤治療藥物。然而相當(dāng)一部分腫瘤細(xì)胞,特別是一些高度惡性腫瘤表現(xiàn)出對(duì)TRAIL的原發(fā)性或繼發(fā)性耐藥。闡述這類腫瘤細(xì)胞的耐藥機(jī)制對(duì)于有效的使

3、用TRAIL具有重要意義。在細(xì)胞凋亡通路中任何關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)的功能失調(diào)都會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞耐藥的產(chǎn)生。
　　 眾所周知,細(xì)胞凋亡過程是復(fù)雜的生物調(diào)控過程,主要是通過死亡受體途徑和線粒體途徑來介導(dǎo),兩者之間相互交叉,又能相互擴(kuò)大來自對(duì)方的死亡信號(hào),其中線粒體含有的多種成分如SMAC,細(xì)胞色素c更是對(duì)凋亡起著重要的調(diào)節(jié)作用,因此我們認(rèn)為通過擴(kuò)大或放大線粒體信號(hào)通路,也許能夠有效逆轉(zhuǎn)細(xì)胞耐藥。線粒體的穩(wěn)定性與Bcl-2家族蛋白有著極大的關(guān)聯(lián),這個(gè)家

4、族包括促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白兩大類:前者包括Bax、Bak、Bid、Bad等,而后者包括Bcl-2、Bcl-XL等,兩類蛋白的比例直接影響線粒體的穩(wěn)定性,從而觸發(fā)或抑制凋亡過程。其中Bax是一種重要的促凋亡蛋白。
　　 蛋白的翻譯后修飾是決定蛋白表達(dá)水平的一個(gè)重要因素。所有機(jī)體組織細(xì)胞中都存在溶酶體途徑、calpain系統(tǒng)、泛素-蛋白酶體途徑和泛素非依賴性等多種蛋白降解途徑,其中泛素-蛋白酶體途徑作用范圍非常廣泛。泛素化的蛋白質(zhì)

5、可以通過泛素-蛋白酶體途徑(ubiquitin-proteasome pathway)降解?？傊?通過我們的前期工作發(fā)現(xiàn)細(xì)胞中促凋亡蛋白Bax表達(dá)水平下降是藥物治療腫瘤過程中的一個(gè)頻發(fā)事件,可能與腫瘤的藥物抵抗密切相關(guān)。
　　 本實(shí)驗(yàn)的研究目的是通過泛素-蛋白酶體途徑對(duì)促凋亡蛋白Bax表達(dá)調(diào)控機(jī)制的研究,探討在泛素調(diào)節(jié)下Bax水平、構(gòu)象、位置的變化,擬從整體角度闡述泛素-蛋白酶體系統(tǒng)對(duì)細(xì)胞內(nèi)關(guān)鍵蛋白的調(diào)節(jié)作用,為治療提供新的靶點(diǎn)

6、。
　　 方法:
　　 一、研究TRAIL誘導(dǎo)惡性淋巴瘤細(xì)胞凋亡情況:
　　 1.細(xì)胞培養(yǎng)及處理:本研究選擇B型惡性淋巴瘤細(xì)胞Raji、U937和人B淋巴母細(xì)胞Hmy2.ciR為研究對(duì)象。細(xì)胞經(jīng)RPMI1640培養(yǎng)基常規(guī)傳代培養(yǎng),待細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí),使用濃度為500ng/mlTRAIL處理細(xì)胞。
　　 2.細(xì)胞凋亡檢測(cè):分別采用500ng/mlTRAIL處理各組細(xì)胞,于0、6、24h不同時(shí)點(diǎn)收集2m

7、l處理后的細(xì)胞,離心洗滌后經(jīng)碘化丙錠(PI)和AnnexinV-FITC染色,采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。
　　 3.細(xì)胞凋亡中caspase-8、9酶活性測(cè)定:500ng/mlTRAIL處理各組細(xì)胞后,于0、6、24h不同時(shí)點(diǎn)收集10ml處理后的細(xì)胞,離心處理后加入caspase-8、9熒光底物30℃水浴15min,加入1％的醋酸鈉終止反應(yīng)。用TD-700熒光光度計(jì)在400/505nm反應(yīng)所釋放的熒光。
　　 4.采用

8、MTT法繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線:收集細(xì)胞按照每孔1×104個(gè)細(xì)胞設(shè)3個(gè)復(fù)孔,500ng/mlTRAIL處理各組細(xì)胞后,分別于0、2、4、6、8、24h取出細(xì)胞進(jìn)行MTT檢測(cè),繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。
　　 二、研究TRAIL誘導(dǎo)惡性淋巴瘤細(xì)胞凋亡過程中Bax表達(dá)情況：
　　 1.靜息狀態(tài)下細(xì)胞內(nèi)源性Bax蛋白的表達(dá)水平和穩(wěn)定性:靜息狀態(tài)下收集細(xì)胞提取蛋白,western-blot檢測(cè)Bax蛋白的表達(dá)情況。
　　 2.采用we

9、stern-blot檢測(cè)TRAIL處理后細(xì)胞Bax蛋白表達(dá)水平及活性狀態(tài)3.采用RT-PCR檢測(cè)TRAIL處理后細(xì)胞Bax基因表達(dá)水平4.采用細(xì)胞亞結(jié)構(gòu)分離技術(shù)和western-blot觀察TRAlL,處理后Bax在細(xì)胞內(nèi)定位情況。
　　 三、研究泛素-蛋白酶體途徑對(duì)細(xì)胞內(nèi)Bax蛋白表達(dá)變化的調(diào)節(jié)作用1.泛素-蛋白酶體途徑在TRAIL作用過程中對(duì)Bax的調(diào)節(jié)作用,采用免疫共沉淀和western-blot檢測(cè)TRAIL作用過程中B

10、ax和泛素結(jié)合情況2.在體外狀態(tài)下模擬泛素-蛋白酶體途徑對(duì)Bax蛋白的調(diào)節(jié)作用。
　　 四、蛋白酶體抑制劑對(duì)惡性淋巴瘤耐藥機(jī)制的調(diào)節(jié)作用1.蛋白酶體抑制劑和TRAIL協(xié)同誘導(dǎo)惡性淋巴瘤凋亡的情況2.蛋白酶體抑制劑對(duì)Bax蛋白表達(dá)水平的調(diào)節(jié)作用結(jié)果:500ng/ml的TRAIL體外處理惡性淋巴瘤細(xì)胞Raji、U937,發(fā)現(xiàn)24小時(shí)后此兩種細(xì)胞的凋亡率明顯低于正常對(duì)照細(xì)胞Hmy2.ciR,Western-blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)TRAIL處

11、理淋巴瘤細(xì)胞24小時(shí)后Bax蛋白表達(dá)水平呈明顯的下降趨勢(shì)；而同時(shí)RT-PCR檢測(cè)三種細(xì)胞的BaxmRNA表達(dá)水平卻未見差異性改變；當(dāng)TRAIL和泛素-蛋白酶體抑制劑PS-341合用后可明顯逆轉(zhuǎn)惡性淋巴瘤細(xì)胞Raji、U937對(duì)TRAIL的耐藥情況,細(xì)胞凋亡率增加,同時(shí)Bax蛋白的表達(dá)水平也呈逐漸增加的趨勢(shì)；采用細(xì)胞亞結(jié)構(gòu)分離技術(shù)發(fā)現(xiàn)TRAIL作用后淋巴瘤細(xì)胞Raji、U937的細(xì)胞漿、線粒體Bax蛋白表達(dá)逐漸減少,而細(xì)胞核的Bax蛋白未

12、發(fā)生明顯變化,TRAIL與蛋白酶體抑制劑PS-341合用后Raji、U937的細(xì)胞漿、線粒體Bax蛋白表達(dá)逐漸增加,細(xì)胞核Bax蛋白仍未發(fā)生明顯變化；TRAIL作用細(xì)胞后Raji、U937的Ubiquitin蛋白表達(dá)逐漸增加；免疫沉淀技術(shù)發(fā)現(xiàn)當(dāng)TRAIL處理細(xì)胞6小時(shí)后,發(fā)生泛素化的Bax蛋白水平明顯增加；加入外源性u(píng)biquitin(2μg/ml)后,淋巴瘤組織的Bax蛋白量逐漸減少,而癌旁組織的Bax蛋白量卻未見明顯變化。