小鼠胚胎干細胞分化為心肌細胞的體外實驗及nesprins在此分化過程中的表達.pdf

1、第一部分：小鼠胚胎干細胞分化為心肌細胞的體外實驗 目的：探索提高胚胎干細胞（embryonic stem cell，ESC）體外誘導分化為心肌細胞的實驗方法。 方法： 1.制備原代小鼠胚胎成纖維細胞（mouse embryo fibroblasts，MEF）飼養(yǎng)層。 2.復蘇129系小鼠ESC至飼養(yǎng)層上培養(yǎng)，當細胞均勻鋪滿六孔板底部80％左右，即可按一定比例傳代或凍存。 3.取未分化的ESC，分別

2、采用懸滴-懸浮-貼壁三步法（懸滴三步法）和懸浮-貼壁兩步法（懸浮兩步法），按誘導劑的不同分為Ⅰ組：丹參+5-氮雜胞苷（5-azacytidine，5-aza）組；Ⅱ組：丹參+維甲酸（retinoic acid，RA）組；Ⅲ組：5-aza；Ⅳ組：丹參組；Ⅴ組：RA組；Ⅵ組：陰性對照組6組進行誘導培養(yǎng)，比較在2種培養(yǎng)方法下各組心肌細胞的分化率。 4.采用RT-PCR檢測ESC時期、培養(yǎng)d7、d7+9的細胞α-MHC和MLC-2v基因

3、mRNA的表達。 5.采用免疫細胞化學方法檢測培養(yǎng)d7+9具有自發(fā)搏動的擬胚體（embryoid bodies，EBs）心肌蛋白α輔肌動蛋白（α-actinin）、肌球蛋白（myosin）、肌動蛋白（α-actin）的表達。 結果： 1.MEF細胞貼壁生長，排列緊密成短梭形。制備的飼養(yǎng)層可用7～10d。 2.生長在MEF上的ESC呈集落狀，顯微鏡下折光性強，細胞間緊密堆積，細胞界限不清。經(jīng)過懸滴三步法和懸

4、浮兩步法培養(yǎng)后形成的聚集物即EBs成立體球狀結構。倒置相差顯微鏡下觀察加入誘導劑第2d（即d7+2）可見自發(fā)性收縮，1個EB可有1個或多個收縮中心。 3.Ⅰ，Ⅲ，Ⅳ，Ⅴ，Ⅵ組采用懸滴三步法培養(yǎng)的心肌細胞分化率分別為（77.78±5.09）％，（66.67±8.82）％，（51.11±1.92）％，（44.44±5.09）％，（23.33±3.34）％；采用懸浮兩步法培養(yǎng)的心肌細胞分化率分別為（42.22±6.94）％，（36.6

5、7±8.82）％，（25.55±10.71）％，（17.78±5.09）％，（10.00±2.84）％。各組心肌細胞分化率懸滴三步法較同組懸浮兩步法高，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。采用懸滴三步法培養(yǎng)Ⅰ組心肌細胞分化率最高，與其它各組比較差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。 4.RT-PCR結果顯示心肌特異性基因α-MHC在d7開始表達，心室肌特異基因MLC-2v在d7+9有表達。 5.免疫細胞化學示心肌特異性結構

6、蛋白α-actinin、myosin、α-actin均成陽性表達。 結論：懸滴三步法聯(lián)合采用中藥丹參與5-aza為誘導劑，可提高體外ESC分化為心肌細胞的分化率。 第二部分：Nesprins基因在小鼠胚胎干細胞分化為心肌細胞過程中的表達 目的：研究nesprins基因在小鼠胚胎干細胞（embryonic stem cell，ESC）分化為心肌細胞過程中的表達，探討nesprins基因在心肌細胞發(fā)育過程中的作用。

7、 方法： 1.體外培養(yǎng)小鼠ESC，采用懸滴-懸浮-貼壁三步法（懸滴三步法），以5-氮雜胞苷（5-azacytidine，5-aza）為誘導劑促ESC分化為心肌細胞。 2.采用RT-PCR和免疫細胞化學方法鑒定心肌細胞。 3.采用RT-PCR檢測ESC時期、培養(yǎng)d7、d7+3、d7+6、d7+9、d7+20的細胞nesprin-1、nesprin-2基因mRNA的表達。 4.采用免疫熒光檢測ESC時期

8、、培養(yǎng)d7、d7+3、d7+6、d7+9、d7+20各時間點nesprin-1蛋白在細胞中的定位。 結果： 1.生長在小鼠胚胎成纖維細胞飼養(yǎng)層上的ESC呈集落狀，相差倒置顯微鏡下折光性強，細胞間緊密堆積，細胞界限不清。經(jīng)過懸滴三步法培養(yǎng)后形成的擬胚體（embryoid bodies，EBs）成立體球狀結構。以5-aza為誘導劑在分化d7+2可見自發(fā)性收縮，1個EB可有1個或多個收縮中心。 2.RT-PCR結果顯示

9、心肌特異性基因α-MHC在d7開始表達，心室肌特異基因MLC-2v在d7+9有表達。免疫細胞化學示心肌特異性結構蛋白α-輔肌動蛋白、肌球蛋白、肌動蛋白均成陽性表達。 3.Nesprin-1、nesprin-2基因mRNA在ESC分化為心肌細胞過程中均有表達且呈動態(tài)變化；Nesprin-1基因mRNA在ESC培養(yǎng)到d7+6時期表達逐漸增高，隨后呈下降趨勢，在d7+20時表達最低（P<0.05）；Nesprin-2基因mRNA在培養(yǎng)