從上皮間充質轉化探討Tbx18陽性心外膜祖細胞向心系細胞分化的機制的研究.pdf

1、2008年蔡晨冷等人利用Cre-LoxP遺傳示蹤發(fā)系統(tǒng)現(xiàn)，小鼠心外膜組織中存在一種新的心臟祖細胞-Tbx18陽性心外膜祖細胞，這種心臟祖細胞不斷遷移分化為心系細胞并對心臟室間隔、心房、心室肌、心瓣膜及冠狀動脈的形成具有重要貢獻。因而，Tbx18陽性心外膜祖細胞有可能成為心臟祖細胞新的來源。學者們發(fā)現(xiàn)，在成年斑馬魚及小鼠心臟損傷處存在心外膜胚胎基因Tbx18的重新激活并通過血管生成作用參與了心臟的損傷修復反應，提示Tbx18陽性心外膜祖細

2、胞可能是心臟損傷修復的潛在的種子細胞。由此可見，深入、全面的研究胚胎時期Tbx18陽性心外膜祖細胞遷移分化為心系細胞的機制對理解成年心臟損傷修復機制有重要啟發(fā)意義。
　　上皮-間充質轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)是指在機體正常發(fā)育過程中以及目前已知的各種生理、病理條件刺激作用下，上皮細胞的結構與功能均會發(fā)生向間葉細胞轉分化的現(xiàn)象:即細胞從具有緊密連接、極性和缺乏動力的上皮細胞表型

3、轉化為細胞間作用松散、無極性、活動力強和能產生細胞外基質的間質細胞。這個過程與胚胎發(fā)育、器官形成、疾病和腫瘤侵襲密切相關。已有研究表明，雞及小鼠胚胎心臟發(fā)育過程中，心外膜祖細胞經歷EMT事件并能分化為血管內皮細胞，冠狀動脈血管平滑肌細胞及心臟成纖維細胞。存在于小鼠心外膜上皮中的Tbx18陽性心外膜祖細胞也有可能是通過EMT事件向心系細胞分化。
　　本研究首先建立和鑒定Tbx18基因敲除小鼠模型和遺傳示蹤小鼠模型。為驗證上皮間充質轉

4、化是Tbx18陽性心外膜祖細胞向心系細胞分化的機制。我們利用Tbx18:Cre/R26RlacZ和Tbx18:Cre/R26REYFP這兩種Tbx18基因遺傳示蹤小鼠模型驗證EMT事件參與了Tbx18陽性心外膜祖細胞向心系細胞分化。同時利用Tbx18基因敲除小鼠模型驗證Tbx18基因敲除小鼠心臟表型和受損上皮間充質轉化的關系。最后利用Tbx18基因敲除小鼠模型和遺傳示蹤小鼠模型深入探討EMT主要標志物Snaill，Smad，Slug，T

5、wist和E-cadherin作為局部信號在Tbx18陽性心外膜祖細胞向心系細胞分化中的作用。
　　第一部分Tbx18基因敲除小鼠模型和遺傳示蹤小鼠模型的建立及鑒定
　　目的:探討建立及鑒定Tbx18基因敲除小鼠模型和遺傳示蹤小鼠模型的方法，為后續(xù)研究Tbx18陽性心外膜祖細胞向心系細胞分化的機制奠定基礎。
　　方法:將引進的Tbx18-Cre基因敲入雜合子小鼠進行繁殖，并用PCR法鑒定其子代基因型。將子代雌雄雜合子小

6、鼠互交，得到的Tbx18基因敲除、雜合子和野生型胚鼠，并用PCR、熒光定量PCR及胚胎大體形態(tài)鑒定出胚鼠基因型。將雜合子小鼠與RosaEYFP和Rosa26RLacz報告小鼠交配，得到Tbx18:Cre/Rosa26REYFP和Tbx18:Cre/Rosa26RLacz雙轉基因胚鼠，心臟行冰凍切片進行免疫熒光檢測。
　　結果:成功繁殖并鑒定了一定數量的Tbx18-Cre基因敲入雜合子小鼠。利用Tbx18-Cre基因敲入雜合子小鼠和

7、報告小鼠成功建立了Tbx18基因敲除小鼠模型和遺傳示蹤小鼠模型。PCR、熒光定量PCR及胚胎大體形態(tài)觀察結論一致性的檢測出基因敲除胚胎。PCR及免疫熒光檢測成功鑒定出Tbx18:Cre/Rosa26REYEP和Tbx18:Cre/Rosa26RLacz雙轉基因胚鼠。
　　結論:成功建立了Tbx18基因敲除小鼠模型和遺傳示蹤小鼠模型。用于繁殖、基因敲除及基因遺傳示蹤的子代基因型鑒定結果均符合孟德爾遺傳規(guī)律。PCR技術鑒定小鼠子代基因

8、型具有廉價、簡單、準確的特點。
　　第二部分上皮間充質轉化是Tbx18陽性心外膜祖細胞向心系細胞分化的重要機制
　　目的:探討Tbx18陽性心外膜祖細胞向心系細胞分化的可能機制。
　　方法:1）觀察Tbx18:Cre/Rosa26REY FP和Tbx18:Cre/Rosa26RLacz不同發(fā)育階段胚鼠Tbx18陽性心外膜祖細胞遷移分化過程。2）通過Tbx18基因敲除模型觀察Tbx18基因敲除小鼠心臟表型和受損上皮間充質

9、轉化的關系
　　結果:1）在E11.5天，Tbx18陽性心外膜祖細胞覆蓋在心臟表面，E13.5天及E16.5天可見Tbx18陽性心外膜上皮細胞向心外膜下遷移形成間充質細胞，即經歷了上皮間充質轉化。這些間充質細胞構成了左右心室壁、心房，室間隔，冠狀動脈血管平滑肌。2）E16.5天基因敲除心臟和野生型相比，四個腔室、瓣膜及右室壁未見異常，左室游離壁及室間隔室壁發(fā)育中等變薄，竇房結頭部缺失。與之相對應的是，E16.5天基因敲除心臟心系細

10、胞標志物（除cTnT外）及間充質細胞標志物vimentin顯著減少。Vimentin顯著減少的部位在室間隔。
　　結論: Tbx18陽性心外膜祖細胞經歷上皮間充質轉化后向心系細胞分化，Tbx18基因敲除小鼠心臟表型和受損上皮間充質轉化存在密切關系。因此上皮間充質轉化是Tbx18陽性心外膜祖細胞向心系細胞分化的重要機制。
　　第三部分上皮間充質轉化主要標志物在Tbx18陽性心外膜祖細胞向心系細胞分化過程中的作用
　　目的

11、:上皮間充質轉化主要標志物Snaill，Smad，Slug，Twist和E-cadherin在Tbx18陽性心外膜祖細胞向心系細胞分化中的作用。
　　方法:利用免疫熒光、Western blot及熒光定量PCR技術比較Tbx18基因敲除小鼠和野生小鼠上皮間充質轉化主要標志物Snaill，Smad，Slug，Twist和E-cadherin的表達差異;利用激光共聚焦技術和流式細胞分選術觀察Tbx18:Cre/Rosa26REYFP不

12、同時期胚胎心臟Tbx18譜系細胞（包括心外膜祖細胞及其后代細胞）內這些上皮間充質轉化主要標志物的時空表達規(guī)律。
　　結果:1）和野生型小鼠相比，Tbx18基因敲除小鼠心臟Snaill，Smad， Slug，Twist在mRNA和蛋白水平表達均顯著下調，E-cadherin顯著上調。2）E16.5天心臟Tbx18譜系細胞和上述上皮間充質轉化主要標志物在室間隔，心瓣膜，冠狀動脈血管平滑肌部位發(fā)生共聚焦。這些標志物和Tbx18基因在E1