上皮細(xì)胞型鈉通道α亞型對精子活力的影響及相關(guān)機(jī)制的初步探討.pdf

1、EnaC 廣泛分布于腎臟、結(jié)腸、肺臟、大腦、卵巢、睪丸和胰腺等組織，其生理功能就是跨越緊密連接上皮單向轉(zhuǎn)運鈉離子。構(gòu)成EnaC的亞基有α、β、γ和δ，其中α和δ直接參與通道空隙的形成，而α2βγ是廣泛分布的EnaC組成方式[4 ]。腎臟和結(jié)腸上皮細(xì)胞的EnaC 接受鹽皮質(zhì)激素的正向調(diào)節(jié)，對于維持血鈉血鉀水平穩(wěn)定十分重要。通過對EnaC的調(diào)控，腎小管兩側(cè)液體的成分和體積就能夠維持穩(wěn)定。在呼吸道上皮組織，鈉離子通過EnaC 吸收，氯離子則通

2、過囊性纖維病跨膜傳導(dǎo)調(diào)節(jié)蛋白受體分泌。呼吸道表面鈉離子和氯離子反向運輸形成的滲透壓驅(qū)動力，決定了呼吸道表面液體容積。生理狀態(tài)下這兩種離子的運輸維持平衡，使呼吸道粘膜表面液體維持在適當(dāng)厚度。這樣既可以保證粘膜纖毛清除率，又不至于讓滲出的液體堵塞呼吸道。
　　 但是在大腦、卵巢、睪丸和胰腺組織，只檢測到ENaC-α和ENaC-δ亞基。這提示ENaC-α和ENaC-δ應(yīng)該是以同源多聚體的形式分別表達(dá)于精子鞭毛中段和頂體。與α、β、γ構(gòu)

3、成的異聚體相比，這種離子通道具有不同的生理和藥理學(xué)特性。在大鼠和人精子上，ENaC-α亞基局限分布在鞭毛中段，它在小鼠精子上也有相同的分布特征；而膜片鉗檢測發(fā)現(xiàn)ENaC對小鼠精子獲能所需的超極化有抑制作用。綜合以上分析，ENaC-α亞基構(gòu)成的ENaC 很可能參與精子活力的調(diào)節(jié)。EnaC家族在精子發(fā)生和活力調(diào)控中所起的作用，目前所知甚少。加之精子形態(tài)結(jié)構(gòu)的特殊性，相應(yīng)的研究手段也受到很多限制。
　　 因此，我們首先運用wester

4、n－blot、免疫熒光檢測ENaC-α在大鼠和人的睪丸、精子上的表達(dá)和定位。初步的結(jié)果支持我們的猜測，即ENaC-α很可能參與精子活力的調(diào)控。為了證實這種推測，繼而使用計算機(jī)輔助精液分析檢測ENaC-α的阻斷劑EIPA（5-(N-ethyl-N-isopropyl)-amiloride hydrochloride）對精子活力的影響?；仡櫿麄€研究過程，我們在實驗中研究了上皮細(xì)胞鈉離子通道α亞基(ENaC-α)在大鼠和人的睪丸、精子上的表達(dá)

5、及其與精子活力之間的關(guān)系，并初步探討ENaC-α在精子活力調(diào)控中的可能作用機(jī)制。
　　 一、檢測ENaC-α在大鼠和人的睪丸、精子上的表達(dá)
　　 本部分的主要實驗?zāi)康氖茄芯可掀ぜ?xì)胞鈉離子通道α亞基(ENaC-α)在大鼠和人的睪丸及精子上是否表達(dá)。
　　 鑒定一種蛋白質(zhì)分子是否存在于某種組織或細(xì)胞，最經(jīng)典的方法就是蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù)（western－blot）。從組織或培養(yǎng)細(xì)胞中提取的蛋白質(zhì)樣品經(jīng)過十二烷基硫酸鈉－

6、丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulphate-polyacrylamidegel electrophoresis,SDS PAGE）和轉(zhuǎn)膜，固定于硝酸纖維素膜。通過特異一抗和相應(yīng)二抗（堿性磷酸酶或者過氧化物酶標(biāo)記）的應(yīng)用，目的蛋白分子被高度特異性地“辨識”。加入含有發(fā)光底物的溶液后，二抗上結(jié)合的辣根過氧化物酶作用于底物發(fā)出熒光使醫(yī)用膠片曝光，最終得到記錄有實驗結(jié)果的膠片。該實驗方法靈敏度非常高，不但可以鑒定蛋白有無和

7、分子量大小，還可以半定量檢測目的蛋白在組織或培養(yǎng)細(xì)胞中的豐度。
　　 本實驗的結(jié)果證實，上皮細(xì)胞鈉離子通道α亞基(ENaC-α)在大鼠和人的睪丸及精子上都有表達(dá)。其分子量約為75KD。
　　 二、免疫熒光和免疫組化染色檢測ENaC-α在大鼠和人的睪丸、精子上的定位
　　 通過上面實驗我們證實上皮細(xì)胞鈉離子通道α亞基(ENaC-α)在大鼠和人的睪丸及精子上都有表達(dá)。但是，它在睪丸中的表達(dá)分布特征是什么樣的？這需要進(jìn)

8、一步的研究。
　　 為此，我們運用免疫組化染色技術(shù)分析其在睪丸的分布特征。試驗結(jié)果顯示，ENaC-α分布于大鼠睪丸的間質(zhì)細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、支持細(xì)胞、Ap型精原細(xì)胞，精母細(xì)胞和精子細(xì)胞以及精子；在人睪丸中，其生精細(xì)胞系亦見明顯陽性表達(dá)。結(jié)果說明，在人和大鼠的睪丸中，ENaC-α都有表達(dá)，而且其分布具有共同特征。
　　 后來運用免疫熒光技術(shù)再次分析其在大鼠睪丸的分布特征。試驗結(jié)果基本與組化染色一致，且在大鼠睪丸組織切片見精

9、子鞭毛上有強(qiáng)陽性表達(dá)。不過相比之下，免疫熒光對胞漿中的目的蛋白顯示更清晰，而免疫組化染色似乎更易于辨識組織中各類細(xì)胞。
　　 隨后運用免疫熒光技術(shù)分析其在大鼠和人精子分布特征。試驗結(jié)果顯示，ENaC-α分布于大鼠和人精子的鞭毛中段，這和前人在小鼠精子上的發(fā)現(xiàn)是一致的。
　　 三、體外精子活力實驗觀測ENaC-α對大鼠和人精子活力的影響
　　 在大腦、卵巢、睪丸和胰腺組織，只檢測到ENaC-α和ENaC-δ亞基。這

10、提示ENaC-α和ENaC-δ應(yīng)該是以同源多聚體的形式分別表達(dá)于精子鞭毛中段和頂體。與α、β、γ構(gòu)成的異聚體相比，這種離子通道具有不同的生理特性，但是仍對鹽酸阿米洛利及其衍生物敏感。在大鼠和人精子上，ENaC-α亞基局限分布在鞭毛中段，它在小鼠精子上也有相同的分布特征；而膜片鉗檢測發(fā)現(xiàn)ENaC對小鼠精子獲能所需的超極化有抑制作用?？赏改さ腸AMP 擬似物或促獲能液體誘導(dǎo)精子獲能時，發(fā)現(xiàn)EnaC的功能被抑制了。綜合以上分析，ENaC-α亞

11、基構(gòu)成的ENaC 很可能參與精子活力的調(diào)節(jié)。EnaC家族在精子發(fā)生和活力調(diào)控中所起的作用，目前所知甚少。加之精子形態(tài)結(jié)構(gòu)的特殊性，相應(yīng)的研究手段也受到很多限制。我們使用EnaC 抑制劑EIPA，間接觀測EnaC活性對精子活力的影響。發(fā)現(xiàn)在獲能的孵育環(huán)境下，EnaC 抑制劑EIPA可以促進(jìn)精子的活力。無論正常人精子還是弱精子組，實驗組精子活力均高于對照組；在大鼠精子組也有同樣的發(fā)現(xiàn)。這個事實說明ENaC-α亞基構(gòu)成的EnaC 至少部分參與

12、精子活力的調(diào)控。
　　 四、總結(jié)
　　 總結(jié)前人的發(fā)現(xiàn)和我們的實驗結(jié)果，認(rèn)為ENaC-α與雄性生殖系統(tǒng)關(guān)系密切，可能對精子活力有調(diào)控作用。在這里，我們第一次提出EnaC 抑制劑EIPA 有促進(jìn)精子活力的作用，并間接證明ENaC-α有抑制精子活力的趨勢。同時，我們從精子周圍環(huán)境pH 變化的角度探討了ENaC-α抑制精子活力的可能機(jī)制。此外，針對ENaC-α有可能研制成為抗雄性生育藥品從而在男性避孕中發(fā)揮重要作用，以及作為一