從Wnt途徑探討高壓氧促離體神經干細胞分化機制.pdf

1、新生兒缺氧缺血性腦病(hypoxic-ischemic encephalopathy，HIE)是足月新生兒腦損傷的最常見原因，可引起新生兒急性死亡和慢性神經系統(tǒng)損傷，從而引起腦癱、癲癇、智力低下等嚴重后遺癥，給家庭社會帶來沉重的負擔。盡管近年來圍產醫(yī)學取得了很大的進展，但HIE仍缺乏有效的治療，其傷殘率及病死率仍高達30％。因此，尋求有效的治療方法足一件迫在眉睫的大事。
　　 高壓氧(hyperbaric oxygen，HBO)

2、治療是目前認為可能有效的治療方法之一。我們的課題組在以前的整體動物實驗中發(fā)現(xiàn)，缺氧缺血性腦損傷(hypoxic-ischemic brain damage，HIBD)新生大鼠的SVZ和DG部位的神經干細胞(Neural stem cells，NSCs)明顯減少，HBO治療可促使SVZ和DG的NSCs增殖(余小河，2006)。課題組進一步證實，HBO治療可以促進HIBD新生大鼠內源性NSCs的增殖，且這種增殖的NSCs可遷移到腦損傷的部位

3、并分化為成熟的神經元；其機制與Wnt信號途徑中Wnt-3蛋白表達的增加及β-catenin蛋白的活化有關(王曉莉，2007)。這些研究結果為HBO治療HIBD的臨床應用提供了有利的理論依據。但我們以前的研究主要足在整體動物水平進行的，細胞水平的研究將更有利于作用和機制的探討，在這以前我們尚未開展細胞水平的研究。
　　 腦損傷發(fā)生后，機體會啟動內源性修復機制，減輕損傷程度。當損傷發(fā)生時存在于腦內內源性NSCs可被激活，對損傷的腦組

4、織起到修復作用。我們課題組既往的實驗已經證實了HIBD新生大鼠的腦組織勻漿可促進BMSCs分化成為神經元樣細胞(謝岷，2007)。因此我們推測，在HIBD后的腦組織會產生某些內源性的抗損傷因子改變了微環(huán)境，喚醒那些蟄伏的內源性NSCs，促使其分化為神經細胞。那么經HBO處理后的新生大鼠腦組織是否也會通過產生某些內源性的抗損傷因子、改變腦組織的微環(huán)境而起到治療作用呢?如果能夠證明這一點，這將為HBO治療的機制提供了新線索。
　　

5、NSCs的體外培養(yǎng)花費昂貴，且懸浮培養(yǎng)的NSCs易貼壁分化，給研究帶來一定的困難。骨髓間充質干細胞(bone marrow stromal cells，BMSCs)是骨髓中的一群未定向分化的干細胞，來源廣泛，取材方便、簡單，在特定分化條件下能分化成神經膠質和神經元，故越來越廣泛的應用于神經方面的研究。在大量的整體動物實驗中已經證實，將BMSCs移植入損傷的大腦，BMSCs可分化為神經細胞，但由于其分化為神經細胞的比例低，限制了其臨床應用

6、。如何擴大其分化為神經細胞的比例呢?根據我們以前的實驗結果，推測HBO有可能起到促使BMSCs向神經元分化的作用。但結果究竟如何，迄今國內外尚未見報道。
　　 近年研究發(fā)現(xiàn)，胚胎期NSCs的發(fā)育與BMP、Wnt等信號系統(tǒng)有密切聯(lián)系。我們在整體動物上已發(fā)現(xiàn)Wnt信號轉導通路與HBO誘導內源性NSCs增殖和分化成為神經細胞密切相關。骨形成蛋白(bonemorphogenetic protein，BMP)不僅參與了神經系統(tǒng)的發(fā)育過程，

7、而且在決定NSCs分化方向中發(fā)揮了重要的調控作用。這兩條信號通路是否在HBO治療后的NSCs分化進程中起作用，尚未見報道。
　　 因此，本課題擬在細胞水平研究HBO誘導BMSCs分化為神經細胞；HBO誘導NSCs分化為神經細胞；HBO對腦組織微環(huán)境的影響；HBO治療的分子機制等內容，為同種自體干細胞移植治療腦損傷提供理論依據。
　　 本課題研究分為以下三部分：
　　 一、高壓氧對骨髓間充質干細胞分化為神經細胞的影

8、響
　　 目的：HBO對離體BMSCs分化的影響及相關機制的初步研究。
　　 方法：取傳至第3-5代BMSCs，加入含10ng/mlbFGF、20ng/mlEGF和2％B27的DMEM/F12(1:1)培養(yǎng)基誘導24小時。將誘導后的BMSCs分為對照組(CON，不作HBO處理)和HBO處理組(HBO，壓力為2ATA，穩(wěn)壓60min，處理1次)。HBO后繼續(xù)培養(yǎng)24h，2組細胞在同一時間行免疫熒光染色，分別進行NSE、GF

9、AP、O4染色，顯微鏡下計數BMSCs分化為NSE陽性細胞、GFAP陽性細胞和O4陽性細胞的百分率。同時用Western-blot檢測2組細胞Wnt3蛋白的表達。
　　 結果：BMSCs用神經干細胞的經典培養(yǎng)基誘導后Nestin表達明顯增加。免疫熒光發(fā)現(xiàn)，HBO組的NSE陽性細胞和O4陽性細胞的分化率與CON組比較明顯增加，且差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；但GFAP陽性細胞的分化率2組之間無統(tǒng)計學差異(P>0.05)；We

10、stern-blot檢測Wnt3的表達，發(fā)現(xiàn)HBO組Win3的表達明顯比CON組增多，具有統(tǒng)計學意義，P<0.05。
　　 結論：HBO可以促進BMSCs向神經元細胞和少突膠質細胞分化，其機制可能與Wnt3蛋白的活化有關。
　　 二、高壓氧和腦組織勻漿對NSCs分化的影響
　　 目的：本研究旨在探討HBO和腦組織微環(huán)境改變對離體NSCs分化的影響。
　　 方法：取出生3日內新生Sprague-Dawley

11、大鼠的腦皮質組織，在含B27，bFGF和EGF的DMEM/F12培養(yǎng)肇中懸浮培養(yǎng)NSCs，傳代后行Nestin，NSE，GFAP免疫熒光染色，進行鑒定。第一步，找出HBO作用的最佳壓力和時間。將傳至2-3代的NSCs分為7組：對照組(CON，不作HBO處理)；HBO組根據不同的壓力(1ATA，2ATA，3ATA)和時間(30 min，60 min)分為6組(n=6)，即1 ATA-30min，2ATA-30min，3ATA-30min，

12、1ATA-60min，2ATA-60min，3ATA-60min。第二步，采用上述實驗獲得的最佳作用的壓力和時間(2 ATA，60min)，觀察HBO和微環(huán)境改變對NSCs分化的影響，研究分為5組(n=6)：①對照組(CON)，不作HBO及腦組織勻漿處理；②高壓氧處理組(HBO)，NSCs給予HBO(2 ATA，60 min)處理；③正常腦組織勻漿組(NBH)，NSCs與正常腦組織勻漿上清液共培養(yǎng)；④缺氧缺血性損傷腦組織勻漿組(HIBH

13、)，NSCs與HIBD上清液共培養(yǎng)；⑤HIBH+HBO組：NSCs與HIBD上清液共培養(yǎng)1h后行HBO(2 ATA，60 min)處理。HBO后繼續(xù)培養(yǎng)24h，各組細胞在同一時間行免疫熒光染色，分別進行NSE、GFAP、O4染色，熒光顯微鏡下計數NSCs分化為NSE陽性細胞、GFAP陽性細胞和O4陽性細胞的百分率。
　　 結果：NSCs分化為NSE陽性細胞的分化率從低到高依次為CON組，1 ATA-30 min組，1 ATA-6

14、0 min組，3 ATA-30 min組，2 ATA-30min組，3 ATA-60 min組，2 ATA-60 min組；除1 ATA-30min組與CON組之間無統(tǒng)計學差異(P>0.05)，其余各HBO組與對照組之間的差異、同一壓力下60 min組與30 min組之間的差異及2 ATA-60 min組與其他各組之間的差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。CON組、HBO組、NBH組、HIBH組、HIBH+HBO組NSCs分化為NSE陽

15、性細胞和O4陽性細胞的百分率依次增加，且差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。與CON組或HBO組比較，NBH組、HIBH組、HIBH+HBO組NSCs分化為GFAP陽性細胞的百分率減少(P<0.01)。
　　 結論：HBO能夠促使離體NSCs分化為神經元，條件為2ATA，60min穩(wěn)壓時作用最強。HBO、正常和HIBD新生大鼠的腦組織勻漿均能促進離體NSCs向神經元和少突膠質細胞分化，尤其對神經元的分化作用以HBO+HIBD腦勻漿

16、為最強，其次為HIBD腦勻漿。提示HBO能夠增強HIBD腦勻漿中促分化因子的作用。正常和HIBD新生大鼠的腦組織勻漿能抑制離體NSCs向星形膠質細胞分化。
　　 三、高壓氧影響NSCs分化的機制研究
　　 目的：近年研究發(fā)現(xiàn)，胚胎期神經干細胞的發(fā)育不但與Wnt信號系統(tǒng)有密切聯(lián)系，BMP信號轉導通路也發(fā)揮著重要的作用。本部分實驗擬檢測Wnt信號轉導通路和BMP信號轉導通路的關鍵蛋白，探討HBO影響NSCs分化的分子機制，為

17、HBO能更好的應用于臨床提供理論依據。
　　 方法：將傳至2-3代的NSCs分為5組(n=3)，即CON、HBO、NBH、HIBH和HIBH+HBO(具體處理同第二部分)，收集細胞，提取總蛋白、胞漿蛋白、核蛋白，分別檢測Wnt3蛋白、β-catenin蛋白、BMP2蛋白的活性；再將NSCs分為2組：①HBO組：NSCs給予HBO處理；②sFRP2/3+HBO組：加入sFRP2/3(Wnt蛋白的拮抗劑)，使其終濃度為500ng/m

18、l，然后給予HBO處理。HBO后繼續(xù)培養(yǎng)12h，收集細胞，提取總蛋白、胞漿蛋白、核蛋白，分別檢測Wnt3蛋白、βーcatenin蛋白、BMP2蛋白的活性。
　　 結果：CON組、HBO組、NBH組、HIBH組、HIBH+HBO組Wnt3蛋白和BMP2蛋白的表達依次增加(P<0.05)；βーcatenin總蛋白的表達無明顯差異(P>0.05)，基本一致；β-catenin胞漿蛋白的表達依次減少(P<0.05)，而β-catenin

19、核蛋白的表達依次增加(P<0.05)。在加入sFRP2/3后，NSCs向神經元細胞的分化減少(P<0.01)，βーcatenin的入核和BMP2蛋白的表達也明顯比對照組減少(P<0.05)。
　　 結論：Wnt-βーcatenin-BMP信號通路參與了HBO和HIBD腦勻漿促進NSCs向神經元和少突膠質細胞的分化。
　　 結論：
　　 1.HBO可以促進離體BMSCs向神經元和少突膠質細胞分化，其機制可能與Wnt

20、3蛋白的活化有關。
　　 2.HBO能夠促進離體NSCs分化為神經元，條件為2ATA，60min穩(wěn)壓時作用最強。
　　 3.HBO、正常和HIBD新生大鼠的腦組織勻漿均能促進離體NSCs向神經元和少突膠質細胞分化，尤其對神經元的分化作用以HBO+HIBD腦勻漿為最強，其次為HIBD腦勻漿。提示HBO能夠增強HIBD腦勻漿中促分化因子的作用。
　　 4.Wnt-β-catenin-BMP信號通路參與了HBO和HIB