馬尾松花粉多糖及其酯化物對脾細胞[Ca2+]i及細胞因子調控的研究.pdf

1、本實驗室前期研究表明，60％乙醇沉淀的馬尾松花粉多糖經(jīng)硫酸酯化后能促進小鼠脾淋巴細胞內鈣離子濃度的升高，其升高的途徑至少有三種:通過膜表面的L-型鈣離子通道引發(fā)CICR；通過內質網(wǎng)膜上IP3R介導的內鈣釋放；通過膜上鈣庫調控的鈣通道調節(jié)。但是，硫酸酯化多糖作為一種分子量很大的化合物如何作用于細胞，引起細胞內鈣離子濃度的變化，目前尚不清楚。本實驗擬從體外的角度，對硫酸酯化馬尾松花粉多糖引起小鼠脾淋巴細胞內鈣離子升高的機理進行初步探討，并對

2、其產生細胞因子的影響進行初步研究，明確硫酸酯化對松花粉多糖體外免疫增強作用的機理，以期為馬尾松花粉多糖的開發(fā)利用提供理論支持。實驗主要分為以下幾個部分。
　　一、60％乙醇沉淀的馬尾松花粉多糖(PPM60)的提取、純化及硫酸酯化:采用水煮醇沉法提取馬尾松花粉粗多糖，用Savage法重復幾次去除蛋白質，用終濃度為40％、60％、80％乙醇分級沉淀，干燥稱重。選取60％乙醇沉淀組分用Sephacryl S-400HR對多糖進行分離純化

3、及分子量測定，分離出三個組分，PPM60-A、PPM60-B、PPM60-C其分子量為1.44×105、1.2×105、7.26×104Dalton。對100mg PPM60進行硫酸酯化修飾，得到暗黃色產物(SPPM60)128 mg。用氯化鋇-明膠比濁法測定取代度為1.2264。紅外光譜顯示已具有C-O-S和S=O的特征吸收峰，表明多糖已被成功硫酸酯化。
　　二、SPPM60對小鼠脾細胞增殖能力的影響:MTT法檢測不同濃度SPP

4、M60和PPM60作用不同時間對小鼠脾細胞增殖活力的影響。SPPM60在200?g/mL濃度下作用48h對小鼠脾細胞的促增殖率最高，達18。29％。而PPM60對小鼠脾細胞增殖作用較弱。經(jīng)SPPM60(200?g/mL)處理72 h后，細胞增殖速度顯著減慢。對于分離的三個組分及其酯化物，PPM60-A酯化后其促增殖能力最強，比酯化前增加了10.84％。
　　三、SPPM60對小鼠脾臟淋巴細胞內游離鈣離子濃度([Ca2+]i)的影響

5、:以Fura-2/AM為探針，熒光分光光度計檢測 SPPM60處理后[Ca2+]i的變化。SPPM60-A作用5 min內，SPPM60-A組[Ca2+]i與對照組相比均顯著性升高。而TLR4的抑制劑TAK-242加入后再加SPPM60-A刺激，小鼠脾臟淋巴細胞內[Ca2+]i較單獨SPPM60-A組有顯著性降低，但未降到空白對照水平。LY294002(PI3K的抑制劑)能部分抑制SPPM60-A引起的小鼠脾臟淋巴細胞內[Ca2+]i升

6、高。此外PLC的抑制劑U73122能完全抑制SPPM60-A引起的小鼠脾臟淋巴細胞內[Ca2+]i升高。
　　四、PPM60及SPPM60對小鼠脾臟淋巴細胞分泌細胞因子的影響:用酶聯(lián)免疫吸附實驗法檢測SPPM60或PPM60刺激后脾細胞培養(yǎng)上清中IL-2、IL-4的表達。結果SPPM60在200?g/mL條件下刺激48小時，脾細胞培養(yǎng)上清中IL-2、IL-4的產生均有所升高，而加入TLR4的抑制劑TAK-242后，再加SPPM60

7、刺激，IL-2、IL-4的產生與空白對照相比沒有顯著性變化。PPM60對IL-2、IL-4的產生幾乎沒有影響。
　　以上結果表明:(1)PPM60對小鼠脾臟淋巴細胞有較弱的增殖作用，硫酸酯化以后產生顯著性的促增殖作用。(2)SPPM60促進小鼠脾臟淋巴細胞的增殖可能是通過提高細胞內游離鈣離子濃度來實現(xiàn)的。(3)SPPM60促進小鼠脾臟淋巴細胞[Ca2+]i升高與TLR4-PI3K-PLC信號通路有關。(4)SPPM60促進小鼠脾臟