煤焦瀝青煙提取物誘導BEAS-2B細胞惡性轉化及其機制.pdf

1、煤焦瀝青(coal tar pitch,CTP)是煤炭在煉焦過程中的副產物,成分極其復雜,流行病學調查顯示,煤焦瀝青接觸者肺癌的發(fā)病率明顯高于非接觸者,現(xiàn)已將煤焦瀝青引發(fā)的腫瘤劃定為職業(yè)腫瘤。在以往的研究中,多是以煤焦瀝青的某單一成分為研究對象來探討煤焦瀝青對接觸人群的危害和致癌機制的,而煤焦瀝青這一混合物的致癌機制如何,鮮見報道,需要進一步研究。
　　 該研究利用中溫煤焦瀝青煙提取物(coal tar pitch smoke

2、extract)作為誘導劑,建立永生化人支氣管上皮細胞BEAS-2B的惡性轉化模型,在確定細胞發(fā)生惡性轉化的前提下,對細胞整個轉化過程進行分期,觀察不同時期細胞的染色體不穩(wěn)性,通過研究染毒細胞染色體損傷及惡性轉化早期紡錘體檢測點相關基因及蛋白的改變,探討煤焦瀝青煙提取物致細胞染色體不穩(wěn)定性及其可能的致肺癌機制,為進一步研究煤焦瀝青接觸者罹患職業(yè)性肺癌發(fā)病機制提供一定的理論基礎。
　　 方法：
　　 1細胞惡性轉化模型的建

3、立
　　 制備煤焦瀝青煙提取物,通過細胞活力技術的方法測定合適的染毒劑量誘導細胞惡性轉化,并觀察BEAS-2B細胞轉化過程中細胞表型的改變情況。
　　 2染色體不穩(wěn)定性觀察
　　 觀察細胞受煤焦瀝青煙提取物作用后傳代過程中染色體的動態(tài)變化,觀察染色體不穩(wěn)定性。
　　 3煤焦瀝青煙提取物遺傳毒性及紡錘體檢測點功能檢測
　　 用彗星實驗分析觀察煤焦瀝青煙提取物染毒對BEAS-2B細胞造成的遺傳毒性進行

4、觀察；RealTime PCR、免疫細胞化學技術檢測紡錘體檢測點相關基因Mad2,Bub1及其蛋白的表達情況。
　　 4統(tǒng)計學分析
　　 采用SPSS12.0對數據進行統(tǒng)計學分析,對符合正態(tài)分布的數據,以(x)±s表示。兩組數據比較采用 t檢驗,構成比比較采用x2檢驗,多組數據比較采用單因素方差分析,兩兩比較采用LSD法,以α=0.05為檢驗水準。
　　 結果：
　　 1細胞惡性轉化試驗
　　 染

5、毒組20代細胞形態(tài)發(fā)生改變,細胞體積增大,圓形類圓形細胞比例增加,部分細胞呈現(xiàn)成纖維細胞樣改變,胞漿豐富,錨定獨立生長實驗結果顯示細胞惡性程度不高,僅有極少數細胞3周時可以長成大的集落；30代,細胞大小差異顯著,形態(tài)大部分變?yōu)閳A形類圓形,面積增大,細胞內顆粒物增加,部分邊緣呈膜狀向外擴展,軟瓊脂克隆形成細胞經體外擴增培養(yǎng)后生長紊亂,無接觸抑制,細胞已經發(fā)生惡性轉化。流式細胞儀測定30代細胞的細胞周期顯示G1期細胞比例明顯減少,G2/M期

6、細胞比例明顯增加。
　　 2染色體不穩(wěn)定性的觀察
　　 惡性轉化早期染毒組細胞已表現(xiàn)出明顯的染色體不穩(wěn)定性,差異較對照組有統(tǒng)計學意義(P＜0.05),主要表現(xiàn)為細胞染色體數目和結構異常,且異常細胞數目隨著細胞代數的增加有逐漸增多的趨勢。
　　 3煤焦瀝青煙提取物遺傳毒性及紡錘體檢測點功能檢測
　　 煤焦油煙提取物可對受試細胞的DNA造成損傷,染毒組細胞拖尾長度較對照組均明顯增高(P＜0.05)。染毒組30