shRNA真核表達載體干擾多發(fā)性骨髓瘤細胞NOTCH1基因表達的實驗研究.pdf

1、目的:應用短發(fā)夾RNA(short hairpin RNA,shRNA)干擾多發(fā)性骨髓瘤細胞株RPMI8226的NOTCH1基因表達,研究NOTCH1基因干擾對RPMI8226細胞周期、凋亡、IL-6分泌能力以及對抑癌基因蛋白的影響,探尋多發(fā)性骨髓瘤基因治療的新靶點。
　　方法:(1)針對人NOTCH1的基因序列設計合成四對含有短發(fā)夾結(jié)構(gòu)的寡核苷酸序列,將其連入pGPU6/GFP/Neo質(zhì)粒中,構(gòu)建NOTCH1 shRNA真核表達

2、載體,經(jīng)Lipofectamine TM 2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染RPMI8226細胞,RT-PCR的方法篩選出最佳干擾的表達載體。
　　(2)應用四唑鹽(MTT)法繪制細胞生長曲線,觀察NOTCH1 shRNA對RPMI8226細胞增殖的影響;流式細胞儀分析細胞周期分布及細胞凋亡;Western blot檢測NOTCH1 shRNA作用后notch1蛋白及細胞周期蛋白依賴性激酶抑制蛋白p27、p21表達水平的變化。
　　(3)應

3、用固相酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法檢測NOTCH1 shRNA對RPMI8226細胞分泌IL-6的影響;
　　結(jié)果:(1)NOTCH1 shRNA轉(zhuǎn)染72小時后,轉(zhuǎn)染效率達60％±2.34%,采用RT-PCR法篩選出最佳的shRNA為NOTCH1-6260,其序列為Sense5'-CACC GGGACATCACGGATCATATGGTTCAAGAGACCATATGATCCGTGATGTCCCTTTTTTG-3',Anti-sens

4、e5'-GATCCAAAAAAGGGACATCACGGATCATATGGTCTCTTGAACCATATGATCCGTGATGTCCC-3'。
　　(2)NOTCH1 shRNA轉(zhuǎn)染組,陰性對照組(Neg-shRNA)及空白對照組生長增殖率分別為(49.09±2.31)%、(91.73±2.67)%、(98.10±0.41)%,轉(zhuǎn)染組增殖率明顯低于Neg-shRNA組和空白組(p<0.05)。NOTCH1 shRNA轉(zhuǎn)染組、Neg-

5、shRNA對照組、空白對照組的G0/G1期細胞分別為(66.23±3.71)%、(42.27±3.65)%、(40.70±0.92)%,轉(zhuǎn)染組明顯高于其他兩個對照組(p<0.05);S期細胞分別為(31.03±1.49)%、(56.53±1.76)%、(51.83±1.45)%,轉(zhuǎn)染組明顯低于其他兩個對照組(p<0.05)。比較Neg-shRNA對照組和空白組,NOTCH1 shRNA轉(zhuǎn)染組的notch-1蛋白表達下調(diào)(比空白組下降44

6、.54%),抑癌基因蛋白p27表達上調(diào)1.75倍、p21表達上調(diào)1.96倍。NOTCH1 shRNA轉(zhuǎn)染組、Neg-shRNA對照組、空白對照組的凋亡率分別為(46.67±1.31)%、(1.37±0.63)%、(0.85±0.43)%,轉(zhuǎn)染組明顯高于Neg-shRNA組和空白組(p<0.05)。
　　(3)NOTCH1 shRNA組分泌IL-6的OD值(28.18±3.50),較Neg-shRNA組(167.08±7.97)和空

7、白組(185.86±5.61)明顯減低(p<0.05)。
　　結(jié)論:(1)應用RNAi技術(shù),NOTCH1-6260可有效地干擾RPMI8226細胞NOTCH1基因的表達。
　　(2)NOTCH1 shRNA可抑制細胞增殖,阻滯RPMI8226細胞于G0/G1期,上調(diào)p21、p27分子的表達可能是其機制之一。
　　(3)NOTCH1 shRNA可誘導細胞凋亡。
　　(4)NOTCH1 shRNA可下調(diào)與疾病相關(guān)的I