（一）ROS調(diào)節(jié)大鼠血管中膜干細(xì)胞向血管平滑肌細(xì)胞分化機(jī)制的研究（二）Irisin通過ERK信號(hào)通路促進(jìn)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的增殖并部分抑制高糖誘導(dǎo)的凋亡.pdf

1、第一部分、ROS調(diào)節(jié)大鼠血管中膜干細(xì)胞向血管平滑肌細(xì)胞分化機(jī)制的研究
　　研究背景:
　　心血管疾病已經(jīng)成為危脅人類健康的首位疾病。血管疾病常為始發(fā)原因，而且缺乏有效的治療手段。血管平滑肌細(xì)胞的生長異常對(duì)血管病的形成，發(fā)展和疾病預(yù)后起重要作用。目前關(guān)于血管平滑肌細(xì)胞生物學(xué)的研究主要集中在正常血管中成熟的收縮型血管平滑肌細(xì)胞，然而，血管受到損傷后，另一類型的血管平滑肌細(xì)胞，即合成型平滑肌細(xì)胞越來越受關(guān)注。與收縮型平滑肌細(xì)胞相比

2、，合成型平滑肌細(xì)胞的特點(diǎn)表現(xiàn)為生長快，分泌多種細(xì)胞因子或生長因子從而引起血管損傷。然而，關(guān)于合成型平滑肌細(xì)胞的來源至今尚未闡明。
　　目前，公認(rèn)的觀點(diǎn)是，血管損傷后，合成型平滑肌細(xì)胞來源于位于血管中膜的成熟的收縮型平滑肌細(xì)胞去分化或表型修飾。另有觀點(diǎn)認(rèn)為合成型平滑肌細(xì)胞來自骨髓來源干細(xì)胞和血管局部存在的自身干細(xì)胞。顯然，骨髓來源干細(xì)胞對(duì)血管損傷的影響主要局限在早期的炎癥反應(yīng)階段，其分化為合成型平滑肌細(xì)胞的概率極低。因而，合成型平滑

3、肌細(xì)胞更有可能來源于局部血管壁。也就是說，合成型平滑肌細(xì)胞可能來源于收縮型平滑肌細(xì)胞去分化或者局部存在的血管自身干細(xì)胞，然而，兩者的貢獻(xiàn)大小尚無文獻(xiàn)報(bào)道。有趣的是，近期一篇報(bào)道引起了廣泛關(guān)注:血管中膜存在一群(＜10％) SM-MHC(-)干細(xì)胞，稱為中膜多能血管干細(xì)胞(MVSCs)，該細(xì)胞通過激活并分化為合成型平滑肌細(xì)胞，而不是成熟平滑肌細(xì)胞去分化，引起血管病變。盡管未采用條件性平滑肌細(xì)胞譜系示蹤技術(shù)(lineage tracing)

4、來追蹤血管平滑肌細(xì)胞的最終命運(yùn)，但是，該研究再次強(qiáng)調(diào)了系統(tǒng)研究平滑肌細(xì)胞來源的重要性和細(xì)胞體內(nèi)譜系示蹤研究對(duì)血管病理研究的重要意義。
　　研究目的:
　　研究大鼠胸主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞來自中膜多能血管干細(xì)胞的分化，闡明中膜多能血管干細(xì)胞向合成型平滑肌細(xì)胞分化的分子機(jī)制。
　　研究方法:
　　1.大鼠中膜多能血管干細(xì)胞(MVSCs)培養(yǎng):采用酶消化法分離和原代培養(yǎng)大鼠中膜多能血管干細(xì)胞，分別采用干細(xì)胞培養(yǎng)體系和普通

5、培養(yǎng)體系進(jìn)行培養(yǎng)，傳代。
　　2.細(xì)胞分化實(shí)驗(yàn):采用PDGF-BB誘導(dǎo)，使維持于干細(xì)胞培養(yǎng)基中的大鼠中膜多能血管干細(xì)胞向平滑肌細(xì)胞分化;分別采用相應(yīng)的誘導(dǎo)因子使大鼠中膜多能血管干細(xì)胞向骨，軟骨和脂肪分化。
　　3.基因干擾:采用RNAi方法，抑制細(xì)胞內(nèi)Pla2g7或NEDD8基因表達(dá)。
　　4.Real-time RT-PCR:不同條件下獲得的細(xì)胞使用TRIzol法提取總RNA，采用Real-time RT-PCR檢測

6、相應(yīng)基因mRNA表達(dá)水平的變化。
　　5.Western blot實(shí)驗(yàn):采用蛋白裂解液裂解不同條件下獲得的細(xì)胞，BCA試劑盒測定蛋白濃度。獲得的蛋白裂解產(chǎn)物用SDS-PAGE膠進(jìn)行凝膠電泳后檢測相應(yīng)目的蛋白的表達(dá)水平。
　　6.免疫熒光染色:細(xì)胞接種于預(yù)先鋪細(xì)胞爬片的六孔板內(nèi)培養(yǎng)，行相應(yīng)刺激后，固定、封閉后先后加入相應(yīng)一抗和熒光二抗孵育，采用激光共聚焦顯微鏡或普通熒光顯微鏡觀測相應(yīng)蛋白在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)情況。
　　7.流式

7、細(xì)胞術(shù):采用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞表面或細(xì)胞內(nèi)相應(yīng)蛋白的表達(dá)。
　　8.[3H]胸腺嘧啶摻入法:[3H]胸腺嘧啶摻入法檢測細(xì)胞的增殖能力。
　　9.活性氧(ROS)測定:細(xì)胞內(nèi)ROS水平采用DCHF探針結(jié)合后，共聚焦顯微鏡檢測ROS生成，圖像采用IPP軟件計(jì)算。
　　10.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)至少3次，結(jié)果采用單因素方差分析或Holm'st檢驗(yàn)。P＜0.05被認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　研究結(jié)果:
　　1.

8、從大鼠胸主動(dòng)脈新分離培養(yǎng)的中膜多能血管干細(xì)胞(MVSCs)表達(dá)干細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志，在傳統(tǒng)的培養(yǎng)體系(RGM)而不是在干細(xì)胞培養(yǎng)體系(SCGM)中能快速分化為合成型血管平滑肌細(xì)胞:
　　(1)與培養(yǎng)條件無關(guān)，僅有少量新分離的細(xì)胞可貼壁存活并生長。與成熟的收縮型平滑肌細(xì)胞相比，該細(xì)胞的平滑肌細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志，包括αSMA， SM22α，h1-calponin和smoothelin表達(dá)水平極低。
　　(2) RGM培養(yǎng)的細(xì)胞經(jīng)歷向合成型血

9、管平滑肌細(xì)胞的分化，即αSMA，SM22α，h1-calponin和smoothelin表達(dá)水平逐漸增高。
　　(3) SCGM培養(yǎng)的細(xì)胞，其干細(xì)胞標(biāo)志(NFM，Sox10和S100β)的mRNA水平在培養(yǎng)的早期先上調(diào)后下降，最終回到基礎(chǔ)水平;而RGM培養(yǎng)的細(xì)胞，其干細(xì)胞標(biāo)志的mRNA水平與新分離的細(xì)胞相比，未發(fā)生改變。
　　(4)免疫熒光染色的結(jié)果顯示，幾乎所有SCGM培養(yǎng)的P1代細(xì)胞均表達(dá)干細(xì)胞標(biāo)志NFM，Sox10和S

10、100β。Western blot和流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，SCGM和RGM培養(yǎng)的A1代和P1代細(xì)胞均高表達(dá)干細(xì)胞標(biāo)志NFM，Sox10和S100β，其表達(dá)水平在SCGM和RGM培養(yǎng)中逐漸下降，但在RGM培養(yǎng)時(shí)下降水平更為顯著。
　　(5)新分離的細(xì)胞表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞的相關(guān)標(biāo)志CD29，CD90和CD44H，其表達(dá)水平在RGM培養(yǎng)至第10代未見下降。
　　2.SCGM培養(yǎng)的MVSCs細(xì)胞具有多能性:
　　(1) PDGF-

11、BB顯著上調(diào)了SCGM培養(yǎng)的P2代MVSCs的αSMA，SM22α，calponin和smoothelin的表達(dá)。
　　(2)與培養(yǎng)于SCGM的對(duì)照組相比，培養(yǎng)于PDGF-BB的細(xì)胞，其基質(zhì)合成相關(guān)基因如collagenⅠ，collagenⅢ， elastin以及MMP2/9的表達(dá)上調(diào)。
　　(3)與培養(yǎng)于SCGM的對(duì)照組相比，培養(yǎng)于RGM和PDGF-BB的細(xì)胞增殖能力更強(qiáng)，與其平滑肌細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志的表達(dá)正相關(guān)。
　　(

12、4) SCGM培養(yǎng)的P3代MVSCs，分別在相應(yīng)細(xì)胞因子的誘導(dǎo)下，可分化為脂肪細(xì)胞，骨或軟骨細(xì)胞。
　　3.內(nèi)源性活性氧(ROS)在MVSCs向合成型血管平滑肌細(xì)胞分化過程中發(fā)揮負(fù)調(diào)控作用:
　　(1)與分化的大鼠中動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞（RASMCs）相比，MVSCs表達(dá)高水平的內(nèi)源性ROS，在分化為RASMCs過程中，內(nèi)源性ROS表達(dá)逐漸下降。
　　(2)在PDGF誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞(VSMCs)中，抗氧化基因Nrf2，

13、NQO1，GCLC，GR以及SOD2表達(dá)顯著上調(diào)。以上基因在RGM培養(yǎng)的MVSCs中，其表達(dá)水平自P3代開始顯著上調(diào)并維持到P10代細(xì)胞。
　　(3)在SCGM培養(yǎng)的P2代MVSCs，加入ROS清除劑Tiron和NAC后，細(xì)胞內(nèi)αSMA，SM22α，calponin和smoothelin表達(dá)顯著上調(diào)。而且，與未加入ROS清除劑的MVSCs相比，誘導(dǎo)的VSMCs增殖能力更強(qiáng)。
　　4.脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2(Phospholip

14、ase A2，group7，Pla2g7)通過生成ROS在MVSCs向合成型血管平滑肌細(xì)胞分化過程中發(fā)揮負(fù)調(diào)控作用:
　　(1)在PDGF誘導(dǎo)的MVSCs向VSMCs分化過程中，Pla2g7的mRNA表達(dá)下降。
　　(2)抑制Pla2g7基因表達(dá)增強(qiáng)了MVSCs向VSMCs分化。
　　結(jié)論:
　　1.新分離的存活的大鼠胸主動(dòng)脈中膜的細(xì)胞是一類中膜多能血管干細(xì)胞(MVSCs)，該細(xì)胞具有多能性，能快速分化為合成型血

15、管平滑肌細(xì)胞。
　　2.內(nèi)源性活性氧(ROS)對(duì)維持MVSCs的未分化狀態(tài)起關(guān)鍵作用，抑制內(nèi)源性ROS生成啟動(dòng)了MVSC向合成型VSMCs的分化。
　　3.Pla2g7通過促進(jìn)內(nèi)源性ROS生成，在維持MVSCs的未分化狀態(tài)中發(fā)揮重要作用。
　　第二部分、Irisin通過ERK信號(hào)通路促進(jìn)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的增殖并部分抑制高糖誘導(dǎo)的凋亡
　　研究背景:
　　目前研究證實(shí)，在威脅人類健康的多種慢性代謝性疾病，如代

16、謝綜合征，Ⅱ型糖尿病等，往往伴隨內(nèi)皮細(xì)胞的損傷和功能障礙。血管內(nèi)膜的完整性是血管發(fā)揮功能的保障和前提條件，而在許多慢性代謝性疾病中，內(nèi)皮細(xì)胞增殖與凋亡對(duì)維持血管內(nèi)膜的完整性發(fā)揮關(guān)鍵作用?；诖?，通過調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和凋亡修復(fù)損傷后的內(nèi)皮細(xì)胞，從而修復(fù)損傷的血管內(nèi)膜，使其恢復(fù)完整性對(duì)許多代謝性疾病引起的血管病的轉(zhuǎn)歸具有重要意義。因此，尋找通過促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖，減少凋亡的理想靶點(diǎn)對(duì)代謝性血管病的治療是目前研究的熱點(diǎn)，但目前的進(jìn)展仍不理想。

17、
　　眾所周知，鍛煉對(duì)代謝性疾病和心血管疾病的預(yù)防和治療具有十分積極的作用。研究證明，Irisin是一種新發(fā)現(xiàn)的肌因子，是連接鍛煉和代謝平衡的橋梁。當(dāng)機(jī)體鍛煉時(shí)，Irisin從骨骼肌中的釋放出來，可廣泛參與機(jī)體適度減肥，改善葡萄糖耐受不良等癥狀。最近的研究發(fā)現(xiàn)，血液中Irisin水平在Ⅱ型糖尿病患者及慢性腎病患者中均降低。另有研究證實(shí)，Irisin可作為肌肉來源的調(diào)節(jié)能量消耗的信號(hào)，通過促進(jìn)棕色脂肪產(chǎn)熱從而在機(jī)體不同組織發(fā)揮功能。

18、研究還發(fā)現(xiàn)，持續(xù)鍛煉可促進(jìn)Irisin表達(dá)，從而使BDNF基因表達(dá)顯著上升。另外，Irisin還可通過調(diào)節(jié)骨細(xì)胞分化在骨代謝中發(fā)揮作用。有趣的是，一項(xiàng)新的證據(jù)表明，Irisin可通過激活STAT3信號(hào)通路促進(jìn)小鼠H19-7 HN細(xì)胞增殖。該研究提示，除了能調(diào)節(jié)機(jī)體代謝平衡，Irisin還具有促增殖的作用。然而，Irisin對(duì)人內(nèi)皮細(xì)胞的作用尚未見任何報(bào)道。
　　研究目的:
　　研究Irisin對(duì)人內(nèi)皮細(xì)胞增殖和凋亡的影響，并

19、闡明Irisin影響人內(nèi)皮細(xì)胞增殖和凋亡的分子機(jī)制。
　　研究方法:
　　1.培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。
　　2.人重組Irisin蛋白表達(dá)與純化進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。
　　3.[3H]胸腺嘧啶摻入實(shí)驗(yàn)檢測Irisin對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖的影響。
　　4.細(xì)胞計(jì)數(shù)法檢測Irisin對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖的影響。
　　5.免疫熒光染色檢測Irisin處理后人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞Ki67的表達(dá)。

20、
　　6.Western blot檢測Irisin處理后人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞信號(hào)通路蛋白及凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)。
　　7.流式細(xì)胞術(shù)檢測Irisin處理后人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡。
　　8.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)至少3次，結(jié)果采用單因素方差分析或Holm's t檢驗(yàn)。P＜0.05被認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　研究結(jié)果:
　　1.Irisin促進(jìn)HUVEC的增殖:
　　(1)[3H]胸腺嘧啶摻入實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，

21、與對(duì)照組相比，無血清條件下20 nM的irisin使HUVEC的[3H]胸腺嘧啶摻入率增加了約2.4倍。
　　(2)細(xì)胞計(jì)數(shù)法的結(jié)果顯示，20nM和40nM的irisin促進(jìn)了HUVEC的增殖。
　　(3) Ki67免疫熒光染色結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，20nM irisin顯著增加了表達(dá)Ki67細(xì)胞的數(shù)量。
　　2.Irisin通過激活ERK信號(hào)通路促進(jìn)HUVEC增殖:
　　(1) Western blot結(jié)果顯

22、示，Irisin處理后，HUVEC的磷酸化ERK的蛋白水平升高，而磷酸化p38 MAPK和AKT的蛋白水平未受影響。
　　(2) ERK抑制劑U0126抑制Irisin誘導(dǎo)的ERK磷酸化后，Ki67免疫熒光染色和[3H]胸腺嘧啶摻入實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，ERK抑制劑抑制了對(duì)irisin誘導(dǎo)的HUVEC的增殖。
　　3.Irisin減少了高糖誘導(dǎo)的HUVEC凋亡:
　　流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，20nM Irisin有效減少了高糖誘導(dǎo)

23、的HUVEC凋亡。
　　4.Irisin下調(diào)了Bax，Caspase-9和Caspase-3的表達(dá)，上調(diào)了抗凋亡蛋白Bel-2表達(dá):
　　Western blot結(jié)果顯示，20nM irisin處理后，Bax，Caspase-9和Caspase-3的表達(dá)下降，抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)升高，GSK-3β與Bad表達(dá)未受影響。
　　結(jié)論:
　　1.Irisin促進(jìn)HUVEC增殖。
　　2.Irisin通過激活E