分解肌酐、尿酸基因工程菌的構(gòu)建及其功能研究.pdf

1、第一章分解肌酐、尿酸基因工程菌的構(gòu)建
　　 目的:構(gòu)建肌酐水解酶基因和尿酸氧化酶基因的聯(lián)合基因，并將其克隆入保加利亞乳酸桿菌，構(gòu)建能高效表達(dá)肌酐水解酶和尿酸氧化酶的乳酸菌基因工程菌。
　　 方法:利用基因融合的方法將尿酸氧化酶和肌酐水解酶進(jìn)行融合，經(jīng)過測(cè)序鑒定后將其連接質(zhì)粒PNZ8048構(gòu)建成重組質(zhì)粒PNZ8048-U-C，并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α，進(jìn)行篩選鑒定，提取重組質(zhì)粒PNZ8048-U-C，電穿孔轉(zhuǎn)化保加利亞乳酸

2、桿菌，篩選鑒定轉(zhuǎn)化子，并制備粗酶液進(jìn)行SDS-PAGE分析檢測(cè)蛋白大小。
　　 結(jié)果:
　　 1.利用基因融合的方法將尿酸氧化酶和肌酐水解酶進(jìn)行融合所構(gòu)建的聯(lián)合基因片段U-C經(jīng)過測(cè)序鑒定與Genbank中尿酸氧化酶和肌酐水解酶的序列一致。
　　 2.成功構(gòu)建重組質(zhì)粒PNZ8048-U-C，將質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，電泳顯示兩酶切片段大小分別約為3.3Kb和1.6Kb，與理論值符合。
　　 3.利用電轉(zhuǎn)化的方法成功

3、將重組質(zhì)粒PNZ8048-U-C轉(zhuǎn)化保加利亞乳酸桿菌，經(jīng)SDS-PAGE分析，重組保加利亞乳酸桿菌表達(dá)重組蛋白的分子量約為61KD，按基因序列圖分析肌酐水解酶253個(gè)氨基酸，而尿酸氧化酶基因含303個(gè)氨基酸，因此我們推測(cè)肌酐水解酶和尿酸氧化酶的聯(lián)合基因片段含氨基酸為556左右，其分子量約為61KD。
　　 結(jié)論:
　　 1.成功構(gòu)建尿酸氧化酶和肌酐水解酶聯(lián)合基因片段。
　　 2.成功利用電轉(zhuǎn)化技術(shù)將含尿酸氧化酶和

4、肌酐水解酶聯(lián)合基因的質(zhì)粒PNZ8048-U-C成功轉(zhuǎn)化保加利亞乳酸桿菌，經(jīng)電泳和基因序列分析符合理論值。
　　 第二章保加利亞乳酸桿菌基因工程菌的遺傳穩(wěn)定性及尿毒素分解能力的體外研究
　　 目的:探索保加利亞乳酸桿菌基因工程菌L.b-UC對(duì)ESRD患者血清中肌酐和尿酸的分解能力，重組質(zhì)粒PNZ8048-U-C的遺傳穩(wěn)定性以及乳酸菌粗酶液的活性，對(duì)基因工程菌的功能學(xué)進(jìn)行進(jìn)一步的探索,并為進(jìn)一步的體內(nèi)研究奠定基礎(chǔ)。
　

5、　 方法:根據(jù)文獻(xiàn)經(jīng)典的檢測(cè)質(zhì)粒遺傳穩(wěn)定性的方法對(duì)重組質(zhì)粒PNZ8048-U-C在有無氯霉素抗性的選擇壓力的條件下分別將其進(jìn)行傳代100代，檢測(cè)其遺傳穩(wěn)定率。制備保加利亞乳酸桿菌基因工程菌的粗酶液，測(cè)定其中尿酸氧化酶和肌酐水解酶的活性。收集我院慢性腎功能不全CKD5期患者共20例，將其血液進(jìn)行離心收集上清液，考察保加利亞乳酸桿菌基因工程菌L.b-UC對(duì)終末期腎衰竭患者血清中肌酐和尿酸的分解能力。
　　 結(jié)果:
　　 1

6、.將重組質(zhì)粒PNZ8048-U-C在有無氯霉素抗性的選擇壓力的條件下分別將其進(jìn)行傳代100代，其遺傳穩(wěn)定率均維持在98％以上，表明重組質(zhì)粒具有良好的遺傳穩(wěn)定性，且不受氯霉素的影響。
　　 2.保加利亞乳酸桿菌基因工程菌L.b-UC的粗酶液中尿酸氧化酶的活性為0.86u/ml，較產(chǎn)朊假絲酵母菌粗酶液活性增加?；蚬こ叹置敢杭◆饷傅幕钚詾?.83u/ml，較斯氏假單胞菌A1501中肌酐水解酶的活性增加。
　　 3.保加

7、利亞乳酸桿菌基因工程菌 L.b-UC對(duì)慢性腎功能不全CKD5期患者血清中肌酐和尿酸具有較強(qiáng)的分解力。
　　 結(jié)論:
　　 1.重組質(zhì)粒PNZ8048-U-C在保加利亞乳酸桿菌中具有良好的遺傳穩(wěn)定性，且其穩(wěn)定遺傳與氯霉素?zé)o明顯相關(guān)性。
　　 2.保加利亞乳酸桿菌基因工程菌 L.b-UC粗酶液中肌酐水解酶和尿酸氧化酶活性較其各自原始菌株活性明顯增高。
　　 3.從體外實(shí)驗(yàn)可以證實(shí)保加利亞乳酸桿菌基因工程菌L.

8、b-UC對(duì)尿毒素具有較強(qiáng)的分解力。
　　 第三章保加利亞乳酸桿菌基因工程菌治療慢性腎衰竭大鼠的療效觀察
　　 目的:構(gòu)建5/6腎切除大鼠模型，初步探討保加利亞乳酸桿菌基因工程菌L.b-UC在體內(nèi)對(duì)肌酐、尿酸的分解能力，對(duì)血脂代謝的影響及其在慢性腎衰竭進(jìn)展中的作用。
　　 方法:雌性各半6周齡SD大鼠隨機(jī)分為5組:1.Sham組(n=8):行假手術(shù)，生理鹽水2mL/d，灌胃，1次/天;2.Model組(n=7):生

9、理鹽水2mL/d，灌胃，1次/天;3.L.B組(n=7):原始保加利亞乳桿菌懸菌液1.5×108cfu/ml×2ml/d，灌胃，1次/天;4.L.b-UC(Qd)組(n=7):L.b-UC懸菌液1.5×108cfu/ml×2ml/d，灌胃，1次/天;5.L.b-UC(BIW)組(n=7)::L.b-UC懸菌液1.5×108cfu/ml×2ml/d，灌胃，2次/周。第2～5組大鼠均行5/6腎切除手術(shù)。手術(shù)12w.后開始對(duì)各組大鼠進(jìn)行灌胃。

10、分別于給藥前和給藥后第4周末，收集24h尿液，測(cè)定24小時(shí)尿量，24小時(shí)尿蛋白總量，并眼眶取血，檢測(cè)血清中總膽固醇和甘油三脂的濃度;于給藥前及給藥后2、4周末眼眶取血，檢測(cè)血清肌酐和尿酸的濃度。各組大鼠于給藥后4周處死。留取腎臟標(biāo)本，用HE和Masson染色，觀察腎臟組織的病理變化，用免疫組化的方法檢測(cè)腎組織TGF-β1的表達(dá)。
　　 結(jié)果:
　　 1.給藥前，各組大鼠體重之間比較無顯著性差異，第4周末，Model組較S

11、ham組體重明顯減輕(P＜0.01)，L.b-UC(Qd)治療組較Model組體重增加(P＜0.05)。
　　 2.灌胃治療前，各5/6腎切除組與sham組大鼠相比，24小時(shí)尿量，24小時(shí)尿蛋白定量及尿蛋白濃度均明顯升高(P＜0.01)。經(jīng)灌胃治療4周后，L.b-UC(Qd)組24小時(shí)尿量、24小時(shí)尿蛋白定量及尿蛋白濃度均Model組顯著性降低(P＜0.01)。而L.b-UC(Biw)組與Model相比各指標(biāo)值有所下降，但無明顯

12、統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　 3.灌胃治療前，各5/6腎切除組與sham組大鼠相比，血清肌酐和尿酸水平均明顯升高，具有顯著性差異(P＜0.01);經(jīng)灌胃治療2周和4周末，L.b-UC(Qd)組和L.b-UC(Biw)組較模型組肌酐和尿酸水平均顯著下降(P＜0.01);治療4周末L.B治療組血清肌酐和尿酸較模型組出現(xiàn)明顯下降(P＜0.01)。不同頻率灌胃的兩L.b-UC治療組相比，
　　 2、4周末L.b-UC(Qd

13、)治療組較L.b-UC(Biw)治療組肌酐和尿酸水平明顯降低(P＜0.01)。2周末和4周末，L.b-UC治療組較原始的L.B治療組，血清肌酐和尿酸下降更明顯，具有顯著性差異(P＜0.01)。
　　 4.灌胃治療前，各5/6腎切除組與sham組大鼠相比，血TG、TC水平均明顯高于Sham組（P＜0.05）。經(jīng)灌胃治療第4周末，L.B和L.b-UC(Qd)組TG、TC水平均明顯低于Model組(P＜0.01)。
　　 5.

14、HE、MASSON染色顯示:Sham組大鼠腎小球、腎小管大小形態(tài)正常，未見小管擴(kuò)張、間質(zhì)炎癥細(xì)胞浸潤及纖維增生性改變。造模第16周末Model組部分腎小球體積增大，腎小球系膜基質(zhì)增多;近端小管上皮細(xì)胞刷狀緣減少或消失，部分腎小管上皮細(xì)胞出現(xiàn)空泡變性，脫落;間質(zhì)區(qū)可見纖維組織增生。L.b-UC(Qd)組腎小管損傷與腎間質(zhì)纖維化與Model組比較明顯減輕（P＜0.05）。
　　 6.TGF-β1免疫組化顯示:與假手術(shù)組相比，5/6腎

15、切除模型組大鼠腎小管TGF-β1的表達(dá)明顯增強(qiáng)(P＜0.05),基因工程菌能在一定程度上減少TGF-β1的表達(dá)(P＜0.05）。
　　 結(jié)論:
　　 1.慢性腎衰竭大鼠經(jīng)喂飼保加利亞乳酸桿菌基因工程菌L.b-UC能夠后能顯著降低血肌酐、尿酸水平，且呈現(xiàn)明顯的量效關(guān)系。
　　 2.導(dǎo)入外源質(zhì)粒后的保加利亞乳酸桿菌基因工程菌L.b-UC降低慢性腎衰大鼠血TG、TC功能未改變。
　　 3.保加利亞乳酸桿菌基因工