MLL2在彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞株LY-3中的表達(dá)和作用.pdf

1、目的:應(yīng)用混合譜系白血病2(MLL2)抗體體外作用于彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞株LY-3以及體內(nèi)作用于種植人LY-3細(xì)胞的荷瘤鼠，以探索研究MLL2抗體在彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤中誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用。
　　方法:
　　1人彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞株LY-3細(xì)胞的培養(yǎng)、傳代
　　人彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞株LY-3細(xì)胞培養(yǎng)于體積分?jǐn)?shù)為10％胎牛血清、1％雙抗的RPMI1640培養(yǎng)液中，置于37℃、飽和濕度、5％CO2條件的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)

2、，48-72小時(shí)傳代一次。細(xì)胞生長良好，懸浮成團(tuán)。本研究相關(guān)實(shí)驗(yàn)均采用對(duì)數(shù)生長期LY-3細(xì)胞。
　　2 RT-PCR檢測(cè)LY-3細(xì)胞中存在MLL2基因表達(dá)
　　取LY-3細(xì)胞懸液，提取總RNA，在核酸蛋白測(cè)定儀上測(cè)定濃度及純度，根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒具體實(shí)驗(yàn)步驟，使RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，配制PCR反應(yīng)體系，其中MLL2前引物序列為5'CCAATGCATAAGATCAAG3'，后引物序列為5' CTATGAAAGTCAGCCATC

3、3'，將其置于Realtime PCR儀上進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后在電泳槽中點(diǎn)樣，由左向右依次加樣:5μl Marker，5μl GAPDH，5μl MLL2，點(diǎn)完后，調(diào)電泳儀各參數(shù)進(jìn)行電泳:U:120V;A:60A;T:35min，電泳結(jié)束，凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。
　　3 MTT法檢測(cè)MLL2抗體作用于LY-3細(xì)胞對(duì)細(xì)胞增殖的影響
　　取LY-3細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為1×105/ml，按100ul/孔接種于U型96孔板，隨機(jī)

4、分為對(duì)照組及MLL2抗體實(shí)驗(yàn)組。對(duì)照組及MLL2抗體實(shí)驗(yàn)組均設(shè)3復(fù)孔，對(duì)照組各孔中加入100ul細(xì)胞培養(yǎng)液，實(shí)驗(yàn)組向各孔中分別加入以100ul細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋的不同濃度的MLL2抗體，使其終濃度分別為0.32ug/ml、0.16ug/ml、0.08ug/ml、0.04ug/ml、0.02ug/ml，置于37℃、5％CO2、飽和濕度條件的培養(yǎng)箱中孵育，分別于加藥后第24小時(shí)、48小時(shí)向各孔中加入20ul MTT(5mg/ml)溶液，置于培養(yǎng)

5、箱內(nèi)繼續(xù)孵育4小時(shí)，離心培養(yǎng)板，吸去上清，每孔再分別加入150ul二甲基亞砜，振蕩器振蕩至結(jié)晶充分溶解，置于酶標(biāo)儀492nm條件下，測(cè)定各孔的吸光度值。
　　4 MLL2抗體體內(nèi)作用于種植人LY-3細(xì)胞的荷瘤鼠觀察其抗腫瘤作用
　　本實(shí)驗(yàn)所用荷瘤鼠購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，共15只，均為3-4周齡Balb/c雌鼠，后飼養(yǎng)于省四院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。首先于體外大量培養(yǎng)并傳代LY-3細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為3-4×105/ml

6、，待細(xì)胞擴(kuò)增到一定數(shù)量級(jí)后，收集細(xì)胞懸液并離心，棄上清液，加入RPMI1640液稀釋，共3.0ml，并吹打混勻，于15只荷瘤鼠左腋下皮下接種LY-3細(xì)胞，每只裸鼠打0.2ml細(xì)胞懸液，瘤細(xì)胞注射的數(shù)量級(jí)為10的7次方。接種瘤細(xì)胞第6天可以看到約黃豆大小的瘤體，14天瘤體長到約1cm左右，排除3只成瘤效果不理想的荷瘤鼠，將其余12只荷瘤鼠編號(hào)，隨機(jī)分為空白對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，每組6只，實(shí)驗(yàn)組每隔2日于荷瘤鼠皮下注射MLL2抗體，抗體終濃度為0

7、.16ug/ml，定期觀察并測(cè)量瘤體大小。MLL2抗體應(yīng)用2周后，肉眼觀察實(shí)驗(yàn)組荷瘤鼠的瘤體較對(duì)照組縮小，頸椎脫臼處死荷瘤鼠，剝離瘤體，用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤的大小，計(jì)算腫瘤的體積，并稱取瘤體重量。機(jī)械法處理腫瘤制成單細(xì)胞懸液，提取其總RNA，進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)，取擴(kuò)增產(chǎn)物，用瓊脂糖凝膠電泳，經(jīng)EB染色，凝膠成像分析系統(tǒng)分析結(jié)果，并提取其總蛋白，采用Western-blot法檢測(cè)MLL2蛋白表達(dá)，通過制備分離膠與濃縮膠、凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、封

8、閉抗體，然后進(jìn)行顯色，采用紅外成像系統(tǒng)進(jìn)行分析與掃描。
　　結(jié)果:
　　1 LY-3細(xì)胞中存在MLL2基因表達(dá)
　　提取LY-3細(xì)胞RNA后在核酸蛋白測(cè)定儀上測(cè)定濃度及純度分別為432.7ng/ul、260/280=1.92，之后依次進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄、PCR擴(kuò)增及瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)結(jié)果顯示LY-3細(xì)胞存在MLL2基因表達(dá)。
　　2 MLL2抗體體外作用于LY-3細(xì)胞能夠誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡
　　LY-3細(xì)胞經(jīng)不

9、同濃度MLL2抗體(即0.32ug/ml、0.16ug/ml、0.08ug/ml、0.04ug/ml、0.02ug/ml)處理24、48小時(shí)后，應(yīng)用MTT法檢測(cè)各標(biāo)本吸光度值均有不同程度減低，MLL2抗體有抗增殖活性，能夠誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。相同處理時(shí)間條件下，尤其在處理48小時(shí)后，在一定濃度范圍內(nèi)，隨著MLL2抗體濃度增加，LY-3細(xì)胞抑制率呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢(shì)。
　　3 MLL2抗體體內(nèi)作用于種植人LY-3細(xì)胞的荷瘤鼠具有抗腫瘤作用<

10、br>　　實(shí)驗(yàn)組MLL2抗體處理的荷瘤鼠，相比對(duì)照組瘤體生長速度慢，瘤體縮小，P＜0.05，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，剝離瘤體組織后，應(yīng)用RT-PCR檢測(cè)ml12基因表達(dá)及Western-blot法檢測(cè)MLL2蛋白表達(dá)，顯示MLL2抗體組相比對(duì)照組，MLL2基因及MLL2蛋白表達(dá)均減低。
　　結(jié)論:
　　1人彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞株LY-3細(xì)胞存在MLL2基因表達(dá);
　　2在一定濃度范圍內(nèi)，隨著MLL2抗體濃度的增加，LY