CCL20基因敲低型人角質形成細胞克隆篩選及其長期體外效應研究.pdf

1、大面積燒傷及其他皮膚損傷患者因自體皮膚來源受限常需大量異體皮膚覆蓋創(chuàng)面。盡管異基因組織工程皮膚產(chǎn)品已初步應用于臨床，但仍無法避免機體對其的排斥反應?？朔@類免疫排斥反應的關鍵技術之一就是要對種子細胞引起排斥反應的重要靶基因進行修飾。趨化因子CCL20通過趨化皮膚移植受者的郎格漢斯細胞在異基因組織工程皮膚移植物的排斥反應中發(fā)揮著關鍵作用。人永生化角質形成細胞系( HaCaT)不僅具有與表皮干細胞相似的表型、增殖和分化特性，而且其遺傳特性穩(wěn)

2、定、不具有成瘤性，可作為組織工程皮膚種子細胞的理想候選者。若能對HaCaT的CCL20基因進行長期穩(wěn)定的下調修飾，則可能達到改良組織工程皮膚種子細胞的目的。在已經(jīng)構建成功人CCL20基因特異性短發(fā)夾RNA(shRNA)重組慢病毒表達載體的基礎上，本研究將利用這些載體感染HaCaT，篩選出陽性細胞克隆，并在mRNA水平、蛋白水平及其對朗格漢斯細胞的趨化效應來檢測其對CCL20基因的干擾效果和體外效應，預期獲得CCL20基因敲低型人角質形成

3、細胞克隆，為制備低免疫排斥反應的新型組織工程皮膚提供種子細胞。 目的: 1.探索不同基因轉移方法將不同大小質粒導入人角質形成細胞的基因轉染效率，為尋找人角質形成細胞的高效基因導入方法提供實驗依據(jù)。 2.基于前一部分的研究結果，采用慢病毒載體攜帶CCL20-shRNA對HaCaT進行基因修飾，經(jīng)G418篩選出CCL20基因特異型HaCaT克隆和CCL20基因錯配型HaCaT克隆，并在CCL20 mRNA水平上初步鑒

4、定其干擾效果。 3.在mRNA和蛋白水平上進一步觀察長期穩(wěn)定傳代的HaCaT克隆的CCL20干擾效應。 4.采用人臍血CD34+細胞，經(jīng)不同細胞因子組合誘導方案，觀察朗格漢斯細胞(CDla+細胞)的產(chǎn)量，并作為LC趨化模型的效應細胞，觀察HaCaT克隆對LC的趨化效應。 方法: 1.分別采用脂質體和陽離子多聚物法將四種不同大小的質粒( pEGFP-N2、pSUPER-EGFP、pHSER-GFP和plox

5、P-EGFP)轉染HaCaT、HeLa和293FT，以熒光倒置顯微鏡計數(shù)綠色熒光陽性的細胞轉染率。 2.采用電穿孔法結合細胞系電轉試劑將四種不同大小的質粒( pEGFP-N2、pSUPER-EGFP、pHSER-GFP和ploxP-EGFP)轉染HaCaT、以熒光倒置顯微鏡計數(shù)綠色熒光陽性的細胞轉染率。 3.采用CaCl2法在293FT包裝重組慢病毒載體pHSER-CCL20-shRNA-GFP-SIN的慢病毒顆粒，以流

6、式細胞術檢測病毒滴度，并將滴度確定的慢病毒轉染HaCaT。 4.采用不同濃度的G418培養(yǎng)基培養(yǎng)HaCaT，篩選具有細胞毒性的G418最低濃度，將慢病毒成功感染的HaCaT用有限稀釋法加樣至96孔板，并結合細胞毒性最低濃度的G418進行壓力篩選5-8周。 5.建立體外炎性細胞因子刺激HaCaT產(chǎn)生CCL20的模型：將HaCaT接種于6孔板中，48h后更換含濃度均為100ng/ml的TNF-α和IL-1β的DK培養(yǎng)基，培養(yǎng)

7、24h后的細胞采用Trizol法提取總RNA，培養(yǎng)48h后的細胞上清被保存于-20℃?zhèn)溆谩?6.熒光定量PCR技術(qPCR):以GAPDH為內標，檢測細胞CCL20 mRNA相對表達量。比較CCL20基因特異型HaCaT克隆和對照組HaCaT細胞CCL20 mRNA相對表達量，觀察CCL20基因特異型克隆對CCL20的下調。 7.酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)：在酶標儀上檢測CCL20標準品和樣本的OD450值。根據(jù)試

8、劑盒中標準品的濃度和OD450值，求出其擬合曲線和方程；將樣品OD450值代入方程，得到樣品中CCL20的蛋白濃度。比較CCL20基因特異型細胞克隆和對照組HaCaT細胞分泌CCL20的濃度，觀察CCL20基因特異型細胞克隆CCL20的下調。 8.先用人淋巴細胞分離液得到臍血單個核細胞，以CD34直接免疫磁珠法對臍血單個核細胞進行直接標記，分選和純化臍血單個核細胞中的CD34+細胞。 9.以5種不同的細胞因子組合誘導方案

9、，對分選出的CD34+細胞進行體外誘導培養(yǎng)，觀察其生長形態(tài)變化、集落的形成，并對誘導培養(yǎng)第6d和第12d的CD34+細胞進行CDlα、HLA-DR等LC表型分子，以及CD40、CD80等共刺激分子表型的檢測。篩選出最佳的LC體外誘導方案。 10.以最佳誘導方案體外培養(yǎng)誘導得到的LC，建立體外LC的趨化實驗模型：以CCL20標準品檢測對LC的趨化效應，以驗證趨化實驗模型的穩(wěn)定性。以不同基因修飾狀態(tài)的HaCaT為對象，觀察HaCaT

10、克隆在TNF-α和IL-1β共刺激48h的細胞上清中產(chǎn)生的CCL20因子對LC的趨化效應。 結果: 1.G418壓力篩選野生型HaCaT的最低細胞毒性濃度為400μg/ml。 2.將pEGFP-N2、pSUPER-EGFP、pHSER-GFP和ploxP-EGFP四種質采用脂質體轉染試劑、陽離子多聚物和電穿孔法聯(lián)合細胞核轉染試劑轉染HaCaT的轉染率分別為1.0～3.3％、1.0~3.7％和3.3％～22.3％；

11、采用脂質體和陽離子多聚物轉染法轉染HeLa的轉染率分別為30.3％～35.7％和33.7％～36.7％；采用脂質體和陽離子多聚物轉染法轉染293FT的轉染率分別為80.0％～84.7％和81.3％～86.7％。將pHSER-GFP包裝成慢病毒轉染HaCaT的轉染率為97％。 3.CCL20-shRNA慢病毒載體經(jīng)包裝后感染HaCaT，轉染率可達90％以上，經(jīng)G418壓力篩選5～8周后共獲得了38株克隆，其中HaCaT-CCL20

12、-shRNAl有12株克隆，HaCaT- CCL20-shRNA2有16株克隆，HaCaT- CCL20-shRNA3有10株克隆。熒光定量PCR初步檢測已傳代10～15代的28株克隆CCL20 mRNA相對量，以HaCaT為對照計算出抑制率：70％-100％的有9株克隆(其中HaCaT-CCL20-shRNA1克隆有4株，HaCaT- CCL20-shRNA2克隆有4株，HaCaT- CCL20-shRNA3克隆有1株)；50％-70

13、％的有4株克隆(其中HaCaT-CCL20-shRNA1克隆有1株，HaCaT-CCL20-shRNA2克隆有3株)；0-50％的有9株克隆(其中HaCaT-CCL20-shRNAl克隆有3株，HaCaT- CCL20-shRNA2克隆有3株，HaCaT- CCL20-shRNA3克隆有3株。)；-293％～0％的有6株克隆(其中HaCaT-CCL20-shRNAl克隆有1株，HaCaT-CCL20-shRNA2克隆有2株，HaCaT-

14、 CCL20-shRNA3克隆有3株。)。 4.采用熒光定量PCR和ELISA進一步分析結果3中CCL20mRNA抑制率>50％的已傳35～45代的11株克隆， CCL20mRNA表達抑制率高達75％以上且其蛋白表達抑制率也高達85％以上的CCL20基因特異型有4株。 5.流式細胞術分析5種細胞因子方案體外誘導培養(yǎng)LC的結果顯示，方案IV、V誘導培養(yǎng)6天和12天的CDla+細胞百分率和CDla+細胞數(shù)量均明顯多于方案I、

15、II和III；方案V誘導培養(yǎng)6天的CD80+和CD40+細胞百分率明顯高于方案IV；方案IV誘導培養(yǎng)12天的HLA-DR+細胞百分率顯著高于方案V。 6.按照方案IV進行體外培養(yǎng)誘導LC，并用于體外趨化實驗，初步結果顯示，相對于未修飾的HaCaT，炎性細胞因子刺激的CCL20基因敲低型克隆對LC趨化效應均受抑制。 結論: 1.常用的化學轉染法較難將外源性基因導入人角質形成細胞，慢病毒法的轉染率明顯優(yōu)于聯(lián)合細胞核轉

16、染試劑的電穿孔法，而且質粒大小不同對導入的效率也有明顯的影響。 2.采用CCL20基因特異型重組慢病毒可高效率地轉染人永生化角質形成細胞( HaCaT)，經(jīng)G418篩選后可獲得CCL20基因特異型細胞克隆。 3.經(jīng)熒光定量PCR和ELISA實驗可以篩選出具有長期穩(wěn)定表達RNA干擾效應的CCL20基因特異型HaCaT細胞克隆. 4.利用細胞因子組合方案IV體外誘導磁珠分選的CD34+細胞，可以獲得高表達CDla+和