TGF-β-,1-基因轉染聯合BMC-MSCs誘導嵌合體在異種心臟移植免疫耐受中作用的實驗研究.pdf

1、本課題克隆了大鼠TGF-β1基因，構建了攜帶目的基因的重組紕逆轉錄病毒載體并且在豚鼠骨髓間充質干細胞中穩(wěn)定表達。通過多次輸注豚鼠骨髓細胞和間充質干細胞建立了一種穩(wěn)定的異基因大鼠嵌合體模型。探討聯合應用嵌合體和TGF-βl逆轉錄病毒基因治療是否能夠在大鼠中誘導出異種心臟移植的免疫耐受，據此來評估TGF-Dl基因和嵌合體在異種移植中的應用前景。 方法： 1、分離大鼠脾細胞，經PHA(10μg/ml)活化24h后，提取細胞總R

2、NA，根據GenBank公布的大鼠TGF-BlcDNA序列設計并合成一對引物P1、P2，采用RT-PCR技術克隆大鼠TGF-βl基因，將RT-PCR產物亞克隆到pMDl8-T載體經PCR鑒定陽性克隆，并將PCR產物用PstI單酶切鑒定和重組克隆載體進行DNA測序鑒定。 2、以測序驗證的pMDl8-T／TGF-β1為模板，分別利用P3、P6；P5、P4二對引物PCR擴增出目的基因片段PCRl和PCR2：再以PCRl、PCR2為模板

3、，利用P3、P4引物PCR擴增出目的基因片段PCR3(基因內PstI酶切位點ctgcag—ctgcaa同義點突變的大鼠TGF-p1)，經雙酶切后正向插入逆轉錄病毒載體pGEZ-Term構建pGEZ-Term-TGF-βI，并經PCR、雙酶切和DNA測序鑒定。 以測序驗證的重組逆轉錄病毒載體pGEZ-Term-TGF-pI與輔助病毒載體pHIT456和pHIT60混合后，脂質體法共轉染293T包裝細胞。利用CPE、GFP觀察和PC

4、R分析(重組)逆轉錄病毒在293T細胞中的包裝成熟和裂細胞釋放。 采用成年豚鼠用貼壁法分離骨髓間充質干細胞并傳代培養(yǎng)，觀察其生長和增殖特性，取第三代培養(yǎng)細胞做細胞生長曲線測定。 獲得的具有感染能力的成熟重組逆轉錄病毒感染骨髓MSCs，經Zeocin篩選獲得抗性細胞株，熒光顯微鏡下觀察GFP在骨髓MSCs中的表達，并RT-PCR、PCR、Westernblot和ELISA檢測大鼠TGF-pI目的基因的轉錄、整合和表達。

5、 3、選用雄性豚鼠和雌性SD大鼠為供受體，隨機將36只大鼠分為六組：所有大鼠受體接受6~Co~射線全身照射，照射后4h內經尾靜脈輸注不同細胞，兩天后經環(huán)磷酰胺注射處理。A組為對照組，輸注生理赫水；B組輸注豚鼠骨髓細胞(BMC)；C組輸注豚鼠骨髓間充質干細胞(BM-MSCs)。D組輸注轉染了TGF-Bl基因的豚鼠骨髓間充質干細胞(BM-MSCs／TGF-pI)，E組和F組先輸注BMC，14天后再次輸注BM-MSCs和BM-MSCs／T

6、GF-Bl，所有細胞輸注量均為2×108，通過MLR、嵌合體的測定來探討耐受機制，并連續(xù)檢測了外周淋巴細胞的變化，流式細胞儀檢測了T淋巴細胞亞群的變化，用ELISA法檢測細胞移植后受體內IFN-7和IL-4、IL．10細胞因子的表達。 4．豚鼠和大鼠作為供受體，隨機分為六組，A組(CVF，n=6)，B組(CVF+BMC，n=6)，C組(CVF+BM-MSCs，n=6)，D組(CVF+BM-MSCs／TGF-β1，n=6)，E組(

7、CVF+BMC+BM-MSCs，n=6)，F組(CVF+BMC+BM-MSCs／TGF-β1，n=6)。應用Ono法行腹腔異種異位心臟移植，記錄移植物存活時間，檢測移植物病理組織學，并進行統(tǒng)計學分析 結果： 1、RT-PCR產物約1000多bp，與克隆的大鼠TGF-β1基因大小相一致；經PCR鑒定RT-PCR產物已亞克隆于pMDl8-T克隆載體；PCR產物經單酶切能釋放出約450bp和700bp大小的片段，表明其很有可能

8、是大鼠TGF-βl基因；DNA序列測定進一步證實其為大鼠TGF-pl目的基因，所克隆的1153bp大鼠TGF-βI基因與GenBank報道的序列完全一致。 2、利用PCR法擴增了PstI酶切位點ctgeg一ctgcaa同義點突變的大鼠TGF-p1基因，并構建了pGEZ-Term-TGF-p1重組逆轉錄病毒載體；經CPE、GFP觀察和PCR鑒定表明在293T細胞中包裝獲得了具有感染能力的成熟重組逆轉錄病毒；全培養(yǎng)骨髓細胞并連續(xù)2～

9、3d換液，10-14天后貼壁的纖維狀細胞融合成片，得到梭形的骨髓間充質干細胞；經GFP觀察、RT-PCR、PCR、Westernblot和ELISA檢測表明獲得了穩(wěn)定表達大鼠TGF-B1的轉基因MSCs。 3、在實驗組輸注BMC，BM-MSCs或BM-MSCs／TGF-βl后，混合嵌合體可以被檢測到，MLR顯示耐受大鼠呈供者特異性耐受。兩次注射者其MLR刺激效因較其他組明顯降低。外周淋巴細胞在全身輻照后下降，于第七天達到最低，隨

10、后逐漸升高到處理后35天僅升至正常水平的20％。T淋巴細胞亞群也呈明顯的降低，特別是CD3+在外周血中的比例。THl／TH2型細胞因子(如INF-~，IL-4andIL．10)在經輸注TGF-βl基因轉染的BM-MSCs后，出現了兩類細胞因子的偏移。 4、移植物的平均存活時間：A組為310min、B組為37lmin、C組為320min、D組為33lmin，E組為55lmin，F組為633min。各組移植物病理表現均為急性血管性排

11、斥反應(AVR)改變，E、F組移植物炎癥細胞浸潤數減少。 結論： 1、成功克隆了大鼠TGF-p1基因和構建了TGF-βl基因內PstI酶切位點同義點突變的pGEZ-Term-TGF-pl。 2、貼壁法可用于分離骨髓間充質干細胞：并獲得了以逆轉錄病毒載體介導的穩(wěn)定表達大鼠TGF-β1的骨髓MSCs。 3、通過在非清髓性法預處理后輸注供體骨髓細胞(BMC)或骨髓間充質干細胞(BM-MSCs)，可以建立混合嵌合