短發(fā)夾RNA沉默HIF-1α、hTERT基因抑制裸鼠皮下人腦膠質瘤生長的實驗研究.pdf

1、目的：研究靶向低氧誘導因子-1 α(HIF-1 α)和人端粒酶逆轉錄酶(hTERT)的短發(fā)夾RNA，對裸鼠人腦膠質瘤中HIF-1 α、hTERT基因表達的抑制作用，以及影響裸鼠膠質瘤的增殖并誘導腫瘤細胞凋亡，為腦膠質瘤的基因治療提供新的依據(jù)。 方法： 1.根據(jù)低氧誘導因子-1 α和人端粒酶逆轉錄酶的cDNA序列，構建表達HIF-1 α mRNA、hTERT mRNA特異的短發(fā)夾RNA (shRNA) 真核表達質粒pshR

2、NA。質粒的大量提取，測序鑒定。 2.體外培養(yǎng)人腦膠質瘤 U251 細胞株。 3.建立人腦膠質瘤裸鼠皮下接種模型，通過腫瘤病理檢查及免疫組化GFAP(膠質纖維酸性蛋白)表達，鑒定腫瘤符合膠質源性特點。 4.治療組為HIF-1 α shRNA+hTERT shRNA組，并設對照組分別為HIF-1 α shRNA組、hTERT shRNA組、脂質體包載的空質粒組、PBS組。每組12只。 5.治療后每兩天測各組

3、腫瘤體積，計算最終抑瘤率。 6．H-E染色觀察質粒治療后移植瘤組織的病理改變。 7．Western免疫印跡法檢測HIF-1 α、hTERT蛋白的表達。 8．腫瘤細胞Annexin V+PI雙染流式細胞儀測凋亡。 結果： 1．成功建立穩(wěn)定的裸鼠人腦膠質瘤細胞株U251皮下移植瘤模型，免疫組化GFAP陽性表達。 2．裸鼠皮下移植瘤模型中HIF-1αshRNA+hTERT shRNA組腫瘤增殖幅

4、度較空質粒組和PBS組明顯減小(P<0.01)，治療3周后起較HIF-1αshRNA組和hTERT shRNA組亦減小(P<0.01)，其最終抑瘤率為84.2％。 3．病理學檢查發(fā)現(xiàn)，HIF-1αshRNA+hTERT shRNA組腫瘤細胞生長受到明顯抑制，細胞散在稀疏，核分裂相少見，血管密度減少，微血管基本失去其基本形態(tài)，可見大量腫瘤細胞壞死及凋亡。 4．HIF-1αshRNA+hTERT shRNA組和HIF-1αs

5、hRNA組裸鼠移植瘤細胞內HIF-1α蛋白表達OD值[(28.8±4.4)％、(27.6±4.1)％]與空質粒組(96.5±6.9)％和PBS組(100％)相比差異顯著(P<0.01)；HIF-1αshRNA+hTERT shRNA組和hTERT shRNA組hTERT的蛋白表達OD值[(34.6±4.6)％、(35.3±4.8)％]與空質粒組(97.4±6.7)％和PBS組(100％)相比差異顯著(P<0.01)。 5．流式細

6、胞儀檢測，HIF-1αshRNA+hTERT shRNA組腫瘤細胞的凋亡率(26.82±2.74)％明顯高于HIF-1αshRNA組和hTERT shRNA組[(10.78±1.20)％、(12.32±1.43)％](P<0.01)以及空質粒和PBS組[(4.32+0.58)％、(2.28+0.26)％] (P<0.01)。 結論： 1．建立的U251裸鼠人腦膠質瘤皮下移植瘤模型在組織病理學上符合人腦膠質瘤特點，生長穩(wěn)