小鼠播散性巨細胞病毒感染的免疫應答和致病機制研究-1)小鼠脾巨噬細胞DNA感受器AIM2識別MCMV DNA激活其炎性體通路的整體研究;2)Th17細胞在急性播散性 MCMV感染致病機制中的作用.pdf

1、目的：
　　1)在整體水平觀察小鼠MCMV感染后脾巨噬細胞內 AIM2炎性體各組分蛋白及其下游促炎因子 IL-1β和IL-18的時序性表達變化,證實 AIM2對 MCMV DNA的識別并探討其炎性體通路在抗 MCMV天然免疫與獲得性免疫機制中的作用;
　　2)在整體水平觀察 MCMV播散性感染急性期脾 Th17細胞的分化及其細胞因子IL-17A在不同臟器內的表達變化,分析 Th17細胞和IL-17A表達與 MCMV載量及脾和

2、唾液腺病理改變的相關性,探討 Th17細胞在急性播散性 MCMV感染致病機制中的作用。
　　方法：
　　1)建立動物模型:45只4.5周齡BALB/c小鼠,腹腔接種(5×103)PFU MCMV Smith株,建立播散性感染模型,另45只小鼠模擬感染做為對照。于病毒接種后3 d、7 d、14 d、28 d(急性期末)和45 d,收集小鼠靜脈血和無菌分離脾、唾液腺、肝和肺組織。為獲取足夠的脾巨噬細胞和血清樣本量,各組每個時間點

3、隨機抽取3只小鼠為1小組,其靜脈血予以混合,脾臟各取2/3加以混合富集巨噬細胞,其余組織樣本隨機抽取3份,故每個時間點的樣本數(shù)為3;
　　2) AIM2炎性體通路蛋白表達:分離小鼠脾臟中巨噬細胞,提取蛋白,用Western blot法檢測AIM2炎性體通路蛋白包括AIM2、ASC、pro-caspase-1和caspase-1的表達強度,設GAPDH為內參蛋白,以各目的蛋白與GAPDH蛋白積分光密度比值(K值)進行半定量分析;

4、r>　　3)血清IL-1β和IL-18水平:用雙抗體夾心ELISA法檢測血清中AIM2炎性體通路下游細胞因子IL-1β和IL-18水平的變化;
　　4)優(yōu)化Th17細胞分化誘導方案:分離3只正常小鼠的脾臟淋巴細胞;分別應用無刺激、滅活MCMV、PMA/Ionomycin、滅活MCMV+PMA/Ionomycin刺激方法;在脾臟淋巴細胞培養(yǎng)刺激不同時間后,采用流式細胞術檢測CD3+CD4 IL-17A+細胞比+率;并用雙抗體夾心EL

5、ISA法檢測培養(yǎng)上清中IL-17A蛋白濃度,觀察分析不同方法誘導Th17細胞分化的效應,選擇最佳的分化誘導方法;
　　5)脾Th17細胞比率和病毒特異性IL-17A表達水平:取急性期階段即感染后3 d、7 d、14 d和28 d的脾組織,分離脾臟淋巴細胞。采用滅活MCMV+PMA/Ionomycin刺激方法誘導Th17細胞分化,用流式細胞術檢測脾臟淋巴細胞中CD3+CD4+IL-17A+細胞比率。用雙抗體夾心ELISA法檢測培養(yǎng)上

6、清中IL-17A濃度時,設立單獨PMA/Ionomycin刺激組作為基礎刺激對照,計算滅活MCMV/PMA/Ionomycin刺激和單獨PMA/Ionomycin刺激脾淋巴細胞培養(yǎng)上清中IL-17A濃度之差值來評估病毒特異性IL-17A表達水平。對比分析兩組之間的差異;
　　6)不同臟器組織中IL-17A蛋白表達:用免疫組織化學染色法檢測急性期試驗小鼠脾、唾液腺、肝、肺組織中IL-17A蛋白的表達分布情況,對比分析不同臟器組織的局

7、部免疫特征;
　　7)脾和唾液腺病理變化:取脾和唾液腺組織切片行HE染色,半定量評估急性期試驗小鼠脾和唾液腺組織的病理變化;
　　8) MCMV病毒載量:用標準空斑試驗檢測急性期各臟器組織內感染性病毒滴度;
　　9)相關性分析:對脾細胞培養(yǎng)上清中病毒特異性IL-17A和組織中IL-17A蛋白表達水平與脾和唾液腺組織病理損傷程度及病毒載量進行相關性分析。
　　結果：
　　1) AIM2炎性體通路蛋白表達:MC

8、MV感染后的脾巨噬細胞提取蛋白中,AIM2炎性體通路各組分包括AIM2、ASC、pro-caspase-1和caspase-1蛋白表達呈現(xiàn)一致性變化,均在感染后3 d(感染早期)顯著升高達峰值,與模擬感染對照組相比差異有統(tǒng)計學意義, K值分別為(1.120±0.243) vs(0.230±0.046);(1.318±0.333) vs(0.248±0.090);(2.049±0.401) vs(0.390±0.120);(1.483±0

9、.420) vs(0.176±0.045),均P<0.01;其后表達均下降,與對照組水平相當;
　　2)血清IL-1β和IL-18水平:MCMV感染組血清IL-1β和IL-18濃度于感染后3 d明顯高于模擬感染對照組,IL-1β濃度為(111.050±28.500)vs(55.858±2.983)pg/ml, P<0.05;IL-18濃度達(99.911±2.222)vs(57.206±6.228)pg/ml,P<0.01;

10、>　　3)優(yōu)化Th17細胞分化誘導方法:無刺激組和滅活MCMV刺激組均不能有效誘導Th17細胞表達。與應用相同方法培養(yǎng)刺激1 d+6 h組及應用PMA/Ionomycin培養(yǎng)刺激6 h組相比,滅活MCMV+PMA/Ionomycin培養(yǎng)刺激6 h組能夠有效誘導Th17細胞分化[Th17細胞比率分別為(0.163±0.035) vs(0.0830.032)％,P<0.05;±(0.1630.035) vs(0.0330.015)％,P<0

11、.01];同時,脾淋巴細胞培養(yǎng)上清中IL-17A濃度也明顯升高[分別為(67.246±±4.578) vs(45.317±±8.793) pg/ml,P<0.05;(67.2464.578) vs(24.4745.134) pg/ml,P<0.01];±±
　　4)脾Th17細胞比率和病毒特異性IL-17A表達水平:MCMV感染后3 d,7 d,14 d,28 d,小鼠脾淋巴細胞體外經(jīng)優(yōu)化方法誘導分化,Th17細胞比率均高于模擬感

12、染對照組[分別為(0.67±0.13) vs(0.22±0.02)％,P=0.004;(0.82±0.02) vs(0.18±0.06)％,P=0.004;(1.14±0.09) vs(0.19±0.04)％,P=0.000;(0.47±0.11)vs(0.20±0.06)％,P=0.017]。MCMV感染組脾淋巴細胞培養(yǎng)上清中病毒特異性IL-17A蛋白濃度在感染后3、7 d雖有升高,但與模擬感染對照組相比無統(tǒng)計學差異(P>0.05);

13、而感染后14 d達峰值,明顯高于對照組[(81.98±12.37) vs(44.96±8.44) pg/ml,P<0.01];至感染后28 d雖有下降,但仍高于對照組[(57.58±8.14) vs(35.10±10.41) pg/ml,P<0.05];
　　5)不同臟器組織中IL-17A蛋白表達:MCMV感染鼠的肝、肺組織中僅于感染后3d可見少量 IL-17A+細胞;脾和唾液腺組織中可見明顯增多的IL-17A+細胞,并于感染后1

14、4 d達峰值,且部分唾液腺分泌管上皮細胞也表達 IL-17A;
　　6)脾和唾液腺病理變化:MCMV感染后14 d脾組織病理損傷程度最重:白髓結構明顯破壞,可見大量吞噬細胞、出血壞死及纖維條索增生;MCMV感染后14 d唾液腺組織病理損傷程度也最嚴重:出現(xiàn)大量炎性浸潤灶,組織結構明顯破壞;
　　7) MCMV病毒滴度:肝和脾組織病毒滴度于感染后3 d升高,其后迅速下降,14 d檢測不到;肺組織病毒滴度低于檢測低限,而唾液腺組

15、織病毒滴度呈逐漸增高趨勢,于感染后14 d達峰值;
　　8)相關性分析:脾淋巴細胞培養(yǎng)上清中病毒特異性 IL-17A蛋白濃度與唾液腺組織病毒滴度呈正相關(r=0.74,P<0.01);脾和唾液腺組織病理損傷越重,脾細胞培養(yǎng)上清中病毒特異性 IL-17A蛋白濃度越高(r=0.78, P<0.01);唾液腺組織內的IL-17A蛋白表達與 MCMV滴度變化呈正相關(r=0.63,P<0.05),并與脾和唾液腺組織病理損傷程度也呈正相關(

16、r=0.68,P<0.01)。
　　結論：
　　1)在 MCMV感染早期,小鼠脾巨噬細胞 AIM2感受器能夠識別胞內 MCMV DNA;AIM2炎性體參與 MCMV感染早期的抗病毒天然免疫應答;同時,通過其下游細胞因子 IL-1β和IL-18在啟動獲得性免疫應答過程中發(fā)揮重要作用。
　　2) MCMV感染急性期 IL-17A蛋白表達呈現(xiàn)明顯組織差異性分布,其在唾液腺中高表達的局部免疫特征可能是 MCMV能夠在唾液腺中長