新型血管生長因子抗體藥物開發(fā)及抗腎腫瘤機制研究.pdf

1、背景： 血管生成對腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移起到關(guān)鍵作用。血管內(nèi)皮細胞生長因子A(VEGF—A)的發(fā)現(xiàn)及對其在病理性血管生成中作用的研究引導了抗VEGF—A藥物在治療腫瘤和其他疾病抗血管治療中的應用。大量研究表明，很多腫瘤中高表達VEGF—A，并與腫瘤的惡性程度及轉(zhuǎn)移性相關(guān)。腎細胞癌(RCC)是一種常見的惡性腫瘤，惡性程度高的腎細胞癌只有有限的治療方法，而且預后較差。這主要由于VHL抑癌基因失活在腎細胞癌中非常常見，從而上調(diào)了VEGF的表

2、達?？贵w具有高特異性和親和力的靶向結(jié)合能力，是一種用于治療的理想藥物。至今為止，市場上主要的單克隆藥物均為鼠源性的。兔抗體由于其更高的特異性、親和力及可識別不同的抗原，已經(jīng)廣泛應用于研究和診斷領域。兔抗的這些特性是作為理想的治療性單克隆抗體所必需的。但因為兔抗為多克隆抗體以及鼠單抗的較早開發(fā)，關(guān)于兔單克隆抗體在治療領域的應用尚未有涉及。從轉(zhuǎn)基因兔中分離出的漿細胞株作為與兔脾細胞淋巴細胞融合的滋養(yǎng)細胞，使兔雜交瘤及兔單克隆抗體成為可能。

3、 方法： 利用改進的兔雜交瘤技術(shù)我們制備了一組抗VEGF—A兔單克隆抗體(RabMAbs)。雜交瘤上清用直接ELISA方法和VEGF/VEGFR2配體受體阻斷ELISA方法篩選。陽性雜交瘤的輕鏈與重鏈基因經(jīng)克隆及表達后，重組抗體用于進一步特征性分析。抗體結(jié)合VEGF—A的特異性及親合力用ELISA和BIAcore的方法測定。抑制VEGF誘導的VEGFR2受體磷酸化的作用由Westernblotting和定量磷酸化ELISA

4、方法檢測。兔單抗的人源化是在對可變區(qū)的序列及同源性分析的引導下完成的，骨架區(qū)和互補決定區(qū)的非人源的位點均被替換。人源化抗體的體外生物活性通過抑制786—O細胞條件培養(yǎng)的HUVEC細胞生長來測定?？贵w的體內(nèi)抑瘤活性在人腎細胞癌裸鼠模型中驗證。腫瘤標本的微血管密度用CD34免疫組織化學染色并定量。 結(jié)果： 共篩選到15個與VEGF—A結(jié)合的中和抗體，可以阻斷VEGF-A和受體VEGFR-2的相互作用及KDR/293細胞中VE

5、GF誘導的受體水平磷酸化。這些抗體特異性和人VEGF—A結(jié)合，并不與其它VEGF亞型交叉，但其中12個抗體與鼠VEGF有交叉結(jié)合。人源化的抗體保持了其來源兔單抗的活性，并具有不同與Bevacizumab的抗原結(jié)合表位。細胞水平的實驗中，該抗體可以抑制786—O條件培養(yǎng)基誘導的HUVEC細胞的增殖。我們在人腎細胞癌裸鼠模型中進一步驗證了其抑制腫瘤生長的活性，在給予和Bevacizumab相同劑量和給藥方案時，表現(xiàn)出更好的效果(p＜0.05