雙功能RGD-TAT修飾的DNA納米膠束的構建及細胞轉運機制研究.pdf

1、基因治療現(xiàn)已成為攻克腫瘤最具希望，也是研究最為活躍的領域?；驅胂到y(tǒng)是基因治療的核心技術?，F(xiàn)階段面臨的最大難題在于尚未找到理想的基因載體，治療基因的導入仍然是腫瘤基因治療的瓶頸。非病毒載體近年來發(fā)展迅速，其中聚乙烯亞胺(polyethyleniminePEI)是近年來研究最為廣泛的陽離子多聚物非病毒基因載體，然而，聚乙烯亞胺作為基因載體使用存在三個突出問題：第一，轉染效率與細胞毒性存在矛盾。小分子PEI雖細胞毒性低，但轉染效果差，高分

2、子量PEI雖具有較理想轉染效率，但細胞毒性強；第二，體液環(huán)境中穩(wěn)定性與穿膜能力存在矛盾。為增加復合物體液環(huán)境中的穩(wěn)定性，應提高PEI/DNA復合物的親水性，但同時穿膜能力也因而受到影響，使轉導效率顯著降低。第三，聚乙烯亞胺靶向性差，解決靶向性問題已成為非病毒載體中最為關注的問題。
　　 基于以上分析，本課題首先采用PluronicP123連接低分子量聚乙烯亞胺(PEI2000)，得到多分枝狀或網(wǎng)狀結構的高分子量PEI衍生物，然后

3、利用整合素αvβ3在人多數(shù)腫瘤細胞和腫瘤新生血管高表達的特點，選擇特異親和該整合素的RGD短肽，與細胞穿膜肽TAT(49-57)連接，合成具有靶向于αvβ3和促進載體穿膜的含RGD和TAT(49-57)雙功能肽RGDC-TAT(命名為R13)，利用交聯(lián)技術將R13與PEI衍生物偶聯(lián)，從而構建新型非病毒基因載體系統(tǒng)P123-PEI-R13，并考察該系統(tǒng)細胞穿膜及胞內轉運、釋放機制。本課題針對PEI作為基因載體使用中存在的問題，旨在保證較高

4、轉染效率情況下，降低PEI細胞毒性，增加其對腫瘤細胞及其新生血管的靶向性，進而提高基因的細胞攝取水平和轉染效率，提高腫瘤的基因治療效果，為基因治療探索一條有效的途徑。
　　 本課題第一部分內容是P123-PEI-R13合成與表征。首先采用固相法制備雙功能肽R13(RGDC-TAT)，并通過電噴霧質譜分析鑒定其序列，通過HPLC測定其相對百分含量，通過表位肽標記的HRP來檢測R13與整合素陽性的Hela細胞與B16細胞的體外結合。

5、進而采用三光氣+琥珀酰亞胺法活化PluronicP123，并以其為反應劑交聯(lián)PEI2KDa，得到高分子量PEI衍生物P123-PEI，再選擇SMCC法將R13按不同反應比與P123-PEI偶聯(lián)，得到目的產(chǎn)物P123-PEI-R13，各反應產(chǎn)物通過IR或1H-NMR進行結構分析。結果表明，成功合成了雙功能肽R13，其序列為Arg-Gly-Asp-Cys-Arg-Lys-Lys-Aarg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg(RGDCRK

6、KRRQRRR)，純度為95.8677％，同時R13體外具有親和整合素αvβ3陽性細胞的能力；成功采用三光氣+琥珀酰亞胺法活化P123并交聯(lián)PEI2KDa，同時成功采用SMCC法將雙功能肽R13與P123-PEI偶聯(lián)，紅外、核磁等結構表征表明目的產(chǎn)物修飾度高、純度好，表明所選合成方法穩(wěn)定、可控、重復性好。
　　 本課題第二部分內容是P123-PEI-R13理化性質。通過測定P123-PEI-R13在37℃下不同時間點分子量的方法

7、評價其水解性能，采用瓊脂糖凝膠電泳阻滯分析考察其縮合DNA能力以及對質粒DNA抗DNaseI、FBS和肝素鈉酶解及解離能力，利用透射電鏡觀察復合物形態(tài)，使用激光粒度儀和zeta電位儀測定粒徑、電位，采用MTT法評價合成的P123-PEI-R13對Hela細胞、B16細胞的毒性，并與PEI25kDa對照。結果表明，聚合物P123-PEI-R13在37℃可緩慢水解，大約60h左右可水解成小分子化合物，其水解過程可用一級動力學方程描述。P12

8、3-PEI-R13/DNA復合物呈近似球形的膠束樣結構，粒徑在100-300nm之間，電位適中。P123-PEI-R13與DNA質量比為2時能與DNA完全結合，同時可抵抗高達280μg/mL的肝素鈉、50％的FBS及6UDNaseI/DNA的解離或酶解。相比較PEI25kDa，P123-PEI-R13細胞毒性顯著降低。
　　 本課題第三部分內容是P123-PEI-R13/DNA納米復合物體內外轉染。以綠色熒光蛋白質粒pEGFP-

9、N2和蟲熒光素酶質粒pGL3-control作為報告基因，評價其對Hela人宮頸癌細胞、B16小鼠黑色素瘤細胞及HepG2人肝癌細胞轉染能力，采用流式細胞儀和發(fā)光儀測定綠色熒光蛋白表達陽性細胞百分率和轉染細胞的蟲熒光素酶活性，分別定性定量考察P123-PEI-R13對各受試細胞體外轉染效率，同時，構建腫瘤模型，以蟲熒光素酶質粒pGL3-Control作為報告基因，評價P123-PEI-R13遞送DNA時在體內的分布與轉染效率。體外轉染試

10、驗表明，在考察的w/w范圍內，隨w/w比提高，轉染效率有逐漸增強的趨勢；隨R13修飾比提高，轉染效率有逐漸下降趨勢；整體而言，P123-PEI-R13在各細胞轉染遠好于PEI2KDa，也好于P123-PEI，比PEI25KDa略強或近似。體內轉染試驗表明，P123-PEI-R13在HepG2人肝癌移植模型與B16小鼠黑色素瘤移植模型轉染情況類似，整體轉染能力較P123-PEI與PEI25KDa強，同時也改善了復合物的體內分布，并且由于R

11、13的修飾，使其在腫瘤組織轉染效率顯著提高，可知聚合物P123-PEI-R13在體內有較強的腫瘤靶向能力，但與其對二種腫瘤細胞的體外轉染相比效率要低。
　　 本課題第四部分內容是P123-PEI-R13/DNA納米復合物穿膜及胞內轉運、釋放機制的研究。本部分采用加入不同內吞途徑抑制劑對轉染效率是否產(chǎn)生影響的方法，考察復合物內吞途徑；采用加入內涵體.溶酶體酸化抑制劑、細胞骨架和動力蛋白抑制劑對轉染效率是否產(chǎn)生影響的方法，考察復合物

12、細胞內轉運機制；采用細胞因子及細胞內環(huán)境是否影響復合物穩(wěn)定性的方法，考察復合物在細胞內的解離；采用熒光標記聚合物并結合激光共聚焦顯微鏡考察復合物在細胞內的實時定位。結果表明，P123-PEI-R13修飾R13后，使其細胞攝取表現(xiàn)出了不同特性，P123-PEI-R13/DNA復合物可通過網(wǎng)格蛋白介導的內吞、小窩蛋白介導的內吞及巨胞飲三條途徑內吞入胞，并可能有不依賴能量的非內吞途徑存在。P123-PEI-R13/DNA復合物入胞后首先經(jīng)內涵

13、體-溶酶體系統(tǒng)酸化過程而從中逃逸，并以微管為軌道和方向，以動力蛋白為動力來源，在微絲作用下，并有中間纖維協(xié)助，向微管“-”端，即細胞核方向轉運。RNA與P123-PEI-R13具有更強親和性，P123-PEI-R13/DNA復合物在細胞核內被RNA解離，從而釋放DNA。
　　 本課題通過PluronicP123連接低分子量PEI制備高分子量PEI衍生物，并利用交聯(lián)技術將雙功能R13與該衍生物偶聯(lián)，研制新型具有主動靶向αvβ3作用