人胰島素C肽對(duì)高脂喂養(yǎng)糖尿病大鼠動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)因子的影響.pdf

1、隨著糖尿病發(fā)病率的不斷提高，近年來(lái)對(duì)糖尿病并發(fā)癥的研究越來(lái)越受到重視。糖尿病動(dòng)脈粥樣硬化常導(dǎo)致心肌梗塞、腦栓塞等嚴(yán)重的心腦血管病變。研究表明2型糖尿病患者的心血管病變不僅其發(fā)生率遠(yuǎn)較非糖尿病人為高，且發(fā)病較早、病變較重、進(jìn)展較快、病死率較高。胰島素C肽是胰島素合成過(guò)程中的降解產(chǎn)物。研究發(fā)現(xiàn)C肽是冠心病等心血管疾病的相關(guān)因素，可能與糖尿病患者動(dòng)脈粥樣硬化有關(guān)。該研究建立C肽表達(dá)載體pGEX-4T-1+C-peptide使C肽在大腸桿菌原核

2、表達(dá)，并用于大鼠，觀(guān)察C肽對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)因子的影響。 第一部分 人胰島素C肽的表達(dá)和純化 目的 構(gòu)建人胰島素C肽表達(dá)載體，并使其在大腸桿菌中得到表達(dá)，獲得人胰島素C肽。 方法 根據(jù)GenBank中C肽序列，合成胰島素C肽cDNA，并將之克隆到融合蛋白表達(dá)載體pGEX-4T-1中，構(gòu)建表達(dá)載體pGEX-4T-1+C-peptide，經(jīng)限制性?xún)?nèi)切酶酶切并經(jīng)DNA測(cè)序證實(shí)為所需要的質(zhì)粒后，將其轉(zhuǎn)染

3、大腸桿菌BL-21，異丙基硫代半乳糖(IPTG)誘導(dǎo)表達(dá)含有C肽和凝血酶的融合蛋白，SDS-PAGE凝膠電泳、考馬斯亮蘭染色證實(shí)有融合蛋白表達(dá)后，谷胱甘肽(GST)純化柱和HitrapBenzamidine柱純化，得到C肽溶液，經(jīng)Western-Blot鑒定為所需表達(dá)C肽后，經(jīng)濃縮、過(guò)濾除菌并配制為工作濃度。 結(jié)果 重組質(zhì)粒的限制性?xún)?nèi)切酶酶切鑒定以及基因測(cè)序結(jié)果與Genbank中C肽cDNA大小及序列一致，誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物、

4、純化產(chǎn)物的電泳結(jié)果分別與C肽凝血酶以及C肽的分子量一致，Western-Blot結(jié)果證實(shí)所得產(chǎn)物為人胰島素C肽。 結(jié)論 利用pGEX-4T-1+C-peptide表達(dá)載體誘導(dǎo)表達(dá)C肽成功并符合要求。 第二部分 胰島素C肽對(duì)鏈脲霉素糖尿病鼠動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)因子的影響 目的 探討人胰島素C肽對(duì)1型糖尿病大鼠動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)因子的影響。 方法 STZ50mg/kg體重腹腔注射W

5、istar大鼠建立1型糖尿病鼠動(dòng)物模型。用藥后一周、兩周、三周尿糖強(qiáng)陽(yáng)性，注射后兩周空腹血糖濃度大于13.88mmol/L的大鼠確定為實(shí)驗(yàn)性大鼠。隨機(jī)分為3組，各組均給以高脂飼料喂養(yǎng)。A組每日給以30R胰島素1單位皮下注射，B組每日給以30R胰島素1單位加C肽3.6μg皮下注射，C組給以30R胰島素1單位加36μgC肽皮下注射。12周后處死大鼠，抽取血液獲得血清、分離巨噬細(xì)胞并留取胸腹主動(dòng)脈血管標(biāo)本。采用硝酸還原酶法測(cè)定血清一氧化氮濃度

6、，化學(xué)比色法測(cè)定腹主動(dòng)脈一氧化氮合酶活性，半定量RT-PCR法檢測(cè)主動(dòng)脈粘附分子(ICAM-1、VCAM-1)、巨噬細(xì)胞CD40及CD40LmRNA表達(dá)量，以β-actin作為內(nèi)對(duì)照。 結(jié)果 普通劑量C肽組、大劑量C肽組NO水平及NOS活性高于單用胰島素組，大劑量C肽組與普通劑量組NO水平相比沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。VCAM-1、ICAM-1、CD40和CD40L半定量RT-PCR顯示，大劑量C肽組相對(duì)光密度值高于單用胰島素組和

7、普通劑量C肽組，普通劑量C肽組相對(duì)光密度值與單用胰島素組相比較，沒(méi)有顯著差異。 結(jié)論 在1型糖尿病鼠動(dòng)物模型，普通劑量C肽能增加NO水平和NOS活性，大劑量C肽能增加VCAM-1、ICAM-1、CD40和CD40L的表達(dá)。 第三部分 胰島素C肽對(duì)2型糖尿病鼠動(dòng)物模型動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)因子影響 目的 探討人胰島素C肽對(duì)2型糖尿病大鼠動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)因子的影響。 方法 2型糖尿

8、病鼠動(dòng)物模型－LOLETF大鼠隨機(jī)分4組，各組均給以高脂飼料喂養(yǎng)。A組每日給以30R胰島素1單位皮下注射，B組每日給以30R胰島素1單位加C肽3.6μg皮下注射，C組給以30R胰島素1單位加C肽36μg皮下注射，D組給予生理鹽水0.02ml皮下注射。12周后處死大鼠，抽取血液獲得血清、分離巨噬細(xì)胞并留取胸腹主動(dòng)脈血管標(biāo)本。采用硝酸還原酶法測(cè)定血清一氧化氮濃度，化學(xué)比色法測(cè)定腹主動(dòng)脈一氧化氮合酶活性，半定量RT-PCR方法檢測(cè)粘附分子(I

9、CAM-1、VCAM-1)、CD40及CD40LmRNA表達(dá)量，以β-actin作為內(nèi)對(duì)照。 結(jié)果 血清NO水平和腹主動(dòng)脈NOS活性測(cè)定結(jié)果顯示，各組之間相比較均沒(méi)有顯著差異。VCAM-1表達(dá)顯示，大劑量C肽組與普通劑量C肽組間沒(méi)有顯著差異，其余各組之間均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。ICAM-1產(chǎn)物表達(dá)測(cè)定顯示，生理鹽水組和普通劑量C肽組沒(méi)有顯著差異，其余各組之間都有顯著性差異。CD40、CD40L結(jié)果顯示大劑量C肽組、生理鹽水組和普

10、通劑量C肽組相對(duì)光密度值顯著高于單用胰島素組，大劑量C肽組、生理鹽水組和普通劑量C肽組間相比較，沒(méi)有顯著差異。 結(jié)論 在2型糖尿病大鼠，C肽的濃度增加，可以明顯增加CD40、CD40L以及ICAM、VCAM的表達(dá)，而對(duì)NO水平和NOS活性影響不大。 第四部分 胰島素C肽對(duì)高脂喂養(yǎng)大鼠動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)因子影響 目的 探討人胰島素C肽對(duì)正常大鼠動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)因子的影響。 方法

11、 正常Wistar大鼠隨機(jī)分3組，各組均給以高脂飼料喂養(yǎng)。A組每日給以C肽3.6μg皮下注射，B組每日給以C肽36μg皮下注射，C組每日給予生理鹽水0.01ml皮下注射。12周后處死大鼠，抽取血液獲得血清、分離巨噬細(xì)胞并留取胸腹主動(dòng)脈血管標(biāo)本。采用硝酸還原酶法測(cè)定血清一氧化氮濃度，化學(xué)比色法測(cè)定腹主動(dòng)脈一氧化氮合酶活性，半定量RT-PCR法檢測(cè)粘附分子(ICAM-1、VCAM-1)、CD40及CD40LmRNA表達(dá)量，以β-actin

12、作為內(nèi)對(duì)照。 結(jié)果 大劑量C肽組NO水平顯著高于生理鹽水組和普通劑量C肽組，生理鹽水組和普通劑量C肽組NO水平相比較沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。大劑量C肽組腹主動(dòng)脈NOS活性顯著高于生理鹽水組，其它各組間沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。VCAM-1和ICAM-1RT-PCR顯示，大劑量C肽組相對(duì)光密度值顯著高于普通劑量C肽組和生理鹽水組，普通劑量C肽組和生理鹽水組間沒(méi)有顯著差異。CD40、CD40L的表達(dá)顯示，大劑量C肽組相對(duì)光密度值顯著高于普通劑