mTOR通路抑制劑依維莫司對膠質瘤自噬作用的研究.pdf

1、研究背景：
　　 腦膠質瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最為好發(fā)的、惡性程度很高的腫瘤，目前臨床給予手術加放療、化療的綜合治療方案后，高級別的膠質瘤患者其中位生存期僅能達到16.7個月，其在很大程度上是由于復發(fā)并形成轉移灶所致。傳統(tǒng)的化療藥物是通過促進細胞的凋亡，達到抑制腫瘤的生長，但耐藥性出現(xiàn)較快。為了逆轉這種現(xiàn)象，我們急需尋找新的細胞蛋白靶點，改進目前的化療方案，延長患者的生存期。細胞死亡目前認為包括3種類型：壞死、凋亡和自噬性細胞死亡。在

2、腫瘤細胞中，凋亡蛋白都有不同程度的缺陷（限制藥物對凋亡通路的激活），自噬（現(xiàn)在被認為是Ⅱ型細胞死亡，有別于細胞凋亡）是指細胞通過單層或雙層膜包裹待降解物形成自噬體，然后形成自噬溶酶體并進行消化及降解，其作為一種細胞的保護機制，其蛋白往往是被優(yōu)先保留的。mTOR信號通路是細胞生長、增殖及細胞周期的中心調控器，其也是PI3K/AKT信號通路（調控細胞自噬）的中心環(huán)節(jié)。依維莫司作為mTOR信號通路特異性的阻斷劑，近年來發(fā)現(xiàn)其對肝癌、胰腺癌等腫

3、瘤有明顯的抗癌作用。但是目前關于mTOR通路及其抑制劑對膠質瘤的研究較少，有以下不足之處：①mTOR相關通路蛋白在人腦膠質瘤的表達及其機制仍未完全明確；②mTOR抑制劑對不同遺傳背景膠質瘤細胞株中對凋亡和自噬的影響及其之間的關系仍不明確；③mTOR抑制劑誘導對膠質瘤裸鼠皮下移植瘤的療效仍不明確。本研究在既往研究的基礎上，試圖通過體外培養(yǎng)來自不同遺傳背景的膠質瘤細胞株U-87MG、U251、SHG44，給予不同濃度的依維莫司，來檢測膠質瘤

4、細胞株給藥前后細胞生長、細胞周期變化及細胞的自噬；并通過建立三種膠質瘤細胞株裸鼠皮下移植瘤模型，給與依維莫司腹腔注射，采用免疫組化、細胞周期、腫瘤血管密度等方法進行測定，來檢測依維莫司對不同細胞株抑制情況。試圖證明mTOR信號通路能夠作為膠質瘤治療的一個新的靶點，為腦膠質瘤的治療提供新的實驗依據(jù)。
　　 研究目的：
　　 探討依維莫司作用于人U87-MG、U251-MG、SHG-44膠質瘤細胞的體內外作用及其可能的機制。

5、
　　 1.培養(yǎng)膠質瘤細胞株U87、U251、SHG44，并用不同濃度的藥物干預細胞的生長，明確其凋亡和自噬情況。
　　 2.建立膠質瘤細胞株U87、U251、SHG44裸鼠移植瘤模型，并用不同濃度的藥物干預移植瘤的生長，明確依維莫司對不同細胞株抑制情況及其機制。
　　 研究方法：
　　 1.免疫組織化學染色檢測32例人腦膠質瘤標本中mTOR信號通路相關蛋白表達情況，并用WesternBlot法檢測人腦膠

6、質瘤標本的mTOR蛋白的表達情況。
　　 2.培養(yǎng)穩(wěn)定生長的膠質瘤細胞株U87、U251、SHG44，采用MTT法觀察不同劑量mTOR抑制劑依維莫司對人腦膠質瘤細胞抑制作用；細胞凋亡熒光Hoechst33342/PI雙染發(fā)測定細胞細胞凋亡；單丹磺酰尸胺(MDC)熒光染色檢測自噬囊泡；流式細胞法定量觀察細胞周期；Westernblot法進一步分析驗證依維莫司對膠質瘤細胞作用的通路及其機理。
　　 3.通過建立膠質瘤細胞株U

7、87、U251、SHG44裸鼠皮下移植瘤模型，并給與依維莫司腹腔注射，采用免疫組化、細胞周期及凋亡、腫瘤血管密度等方法進行測定，了解依維莫司對不同膠質瘤細胞株移植瘤的抑制作用，并探討其可能引起的機制。
　　 研究結果：
　　 1.mTOR蛋白在Ⅲ、Ⅳ級膠質瘤較Ⅰ、Ⅱ級膠質瘤的表達有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)，Ⅰ級膠質瘤與對照組表達無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。
　　 2.體外培養(yǎng)的膠質瘤細胞株中，不同細胞株受抑制

8、程度均隨著依維莫司濃度的增加而增加。其中U87-MG細胞株是最敏感的；U251細胞株有中度敏感性；SHG-44細胞株是最不敏感的。
　　 3.細胞凋亡熒光Hoechst33342/PI雙染結果顯示各株膠質瘤細胞均發(fā)生了一種不同于凋亡的死亡方式，可能為細胞自噬。行MDC活細胞染色顯示，依維莫司作用于膠質瘤細胞增加了酸性囊泡樣細胞器（自噬泡）的形成，可認為依維莫司可促進膠質瘤細胞自噬的形成。三種細胞株均給與IC50劑量的依維莫司，在

9、48小時后進行流式細胞周期分析。我們發(fā)現(xiàn)三種細胞株均有特異性的G0/G1期細胞阻滯。用AnnexinV檢測沒有發(fā)現(xiàn)明顯的細胞凋亡。
　　 4.用Westernblot分析依維莫司作用于膠質瘤細胞株后對mTOR，p70S6K,4E-BP-1和p70S6K的非磷酸化和磷酸化水平的影響。在所有三個細胞株中，隨著依維莫司劑量的增加，mTOR、p70S6K、4E-BP-1的磷酸化表達水平均明顯減少，非磷酸化的p70S6K并沒有發(fā)現(xiàn)具有明顯

10、的變化，只有4E-BP-1的非磷酸化表達水平亦隨依維莫司濃度的升高而有所減少。
　　 5.建立膠質瘤細胞株U87、U251、SHG44裸鼠皮下移植瘤模型，繪制移植瘤生長曲線。在第12天末開始給與裸鼠依維莫司后發(fā)現(xiàn)，各細胞株實驗組裸鼠移植瘤體積較對照組明顯減小，并通過公式測量不同細胞株的抑瘤率，U-87MG，SHG-44，U251細胞株的抑瘤率分別為30.6％,42.1％，29.7％，依維莫司對膠質瘤有明顯的抑制作用。
　　

11、 6.對不同膠質瘤細胞株行細胞凋亡測定，各細胞株中實驗組較對照組的凋亡并沒有明顯的統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。行細胞周期測量，各細胞株中實驗組較對照組均有明顯的G0/G1期停滯(P＜0.05)。其中U-87MG細胞株的G0/G1期停滯較對照組差異最大，SHG-44次之，U251最小。
　　 7.行腫瘤血管密度測定，細胞株U-87MG、U-251中實驗組腫瘤血管密度值較對照組沒有明顯差異(P＞0.05)，細胞株SHG-44實驗組

12、腫瘤血管MVD值為31.1(25.0-37.2)，較對照組20.9(14.8-27.0)有明顯差異(P＜0.05)。進一步測量不同細胞株VEGF的表達水平，在SHG-44細胞株實驗組的VEGF表達水平較對照組明顯下調，其余兩種細胞株間沒有發(fā)現(xiàn)明顯差異。
　　 8.分離腫瘤組織后，免疫組化分析各標本，其中U251細胞株實驗組較對照組的pmTOR表達增加，p70S6K1、pAKT表達減少，VEGF表達沒有明顯差異；U-87MG細胞株

13、實驗組較對照組的表達p70S6K1表達減少，pAKT、pmTOR、VEGF表達均沒有明顯差異；SHG-44細胞株實驗組較對照組的pmTOR、p70S6K1表達均沒有明顯差異、pAKT表達減少，VEGF表達明顯減少。
　　 結論：
　　 1.mTOR抑制劑依維莫司通過阻滯細胞周期，誘導膠質瘤細胞的自噬，并抑制腫瘤血管的生成，從而發(fā)揮抗膠質瘤的作用。
　　 2.mTOR信號通路能夠作為治療膠質瘤的一個新靶點，為腦膠質