內源性大麻素物質anandamide對大鼠的心臟保護作用及其機制.pdf

1、內源性大麻素物質來源于細胞膜上的脂類前體物質,具有脂類物質的特征,包括氨基化合物和長鏈脂肪酸。Anandamide(N-花生四烯酸氨基乙醇,AEA)是一種內源性大麻素物質,為花生四烯酸的衍生物。內源性大麻素物質可以參與機體內許多生理和病理生理過程,如神經行為、胃腸功能、應激和焦慮、心血管功能。到目前為止根據藥理學效應和基因序列,發(fā)現了兩種內源性大麻素受體,1型受體(CB1)和2型受體(CB2)。這兩種受體廣泛分布于機體各種組織細胞,其中

2、包括心肌細胞。據報道內源性大麻素物質對心血管功能的調節(jié)發(fā)揮重要作用。如:內源性大麻素物質可以抑制自發(fā)性高血壓大鼠的心肌收縮力;內源性大麻素物質anandamide可以減輕由腎上腺素或缺血/再灌所導致的心律失常;anandamide可以減輕大鼠離體心臟缺血再灌注損傷。然而,有關anandamide抗心律失常和抗缺血再灌注損傷的機制尚未明嘹。
　　 本研究旨在應用電生理學、功能學、免疫組化和流式細胞等方法探討內源性大麻素物質anan

3、damide的心臟保護作用及其作用機制。研究分為兩部分:(1)應用冠脈結扎方法、細胞內記錄方法、全細胞膜片鉗技術,觀察anandamide對大鼠心肌缺血再灌注所致心律失常的影響,并探討其電生理學機制。(2)應用Langendorff灌注技術,觀察心功能的變化;通過TUNEL,和流式細胞技術檢測細胞凋亡;利用激光共聚焦技術,觀察心室肌細胞內游離鈣濃度。觀察內源性大麻素物質anandamide對大鼠心肌缺血/再灌注損傷(I/R)的作用,并探

4、討其機制。
　　 Ⅰ內源性大麻素物質Anandamide抗大鼠心律失常的電生理學研究
　　 目的:Anandamide是一種內源性大麻素物質,具有抗心肌缺血、抗心律失常等心臟保護作用,但其機制尚未完全明確。本研究旨在探討Anandamide的抗心律失常作用及其電生理學機制。
　　 方法:利用大鼠冠脈結扎方法,觀察anandamide對在體心臟的抗心律失常作用;應用細胞內記錄方法,觀察anandamide對離體心室

5、乳頭肌動作電位的影響;利用全細胞膜片鉗技術,觀察anandamide對心室肌細胞L-型鈣電流以及各種鉀電流的影響,包括瞬時外向鉀電流(Ito)、緩慢延遲整流鉀電流(Iss)、內向整流鉀電流(IK1)和ATP敏感鉀電流(IKATP)。
　　 結果:
　　 (1)Anandamide(1μM.kg-1)顯著抑制I/R誘發(fā)的心律失常。
　　 (2)Anandamide(1、10、100 nM)濃度依賴性的縮短乳頭肌動作

6、電位復極化50％(APD50)和90％(APD90)時程;對部分去極化乳頭肌,Anandamide(100nM)不僅縮短APD50和APD90,同時降低動作電位幅度、超射值和0期最大去極化速度。上述效應可被內源性大麻素1型受體阻斷劑AM251(100 nM)所阻斷,而內源性大麻素2型受體阻斷劑AM630(100 nM)對Anandamide的效應無影響;L型鈣通道開放劑Bay K8644(0.5μM)、鉀通道阻斷劑氯化四乙銨(TEA,2

7、0mM)和NO合酶抑制劑L-NAME(1 mM)對Anandamide的效應無影響。
　　 (3)Anandamide(1、10、100 nM)濃度依賴性降低心肌細胞L型鈣電流,使電流-電壓關系曲線上移。Anandamide(100 nM)不影響L型鈣通道的激活過程,但可以加速穩(wěn)態(tài)失活過程,并且減慢通道失活后的復活。上述效應可以被AM251(100 nM)所阻斷,而AM630(100 nM)對Anandamide的效應無影響。<

8、br>　　 (4)Anandamide(1、10、100 nM)濃度依賴性地降低Ito、增加IKATP,而對Iss和IK1沒有影響。Anandamide使Ito的穩(wěn)態(tài)失活曲線左移,而使其失活后的復活曲線右移。內源性大麻素1型受體阻斷劑AM251和2型受體阻斷劑AM630都不能阻斷anandamide對Ito的抑制效應。內源性大麻素2型受體阻斷劑AM630可以阻斷anandamide增加IKATP的效應,而內源性大麻素1型受體阻斷劑AM

9、251沒有此阻斷效應。
　　 小結:Anandamide具有明顯的抗I/R心律失常作用。Anandamide的抗心律失常作用可能通過內源性大麻素1型受體,導致心肌細胞L型鈣通道失活加速,失活后復活減慢,降低L型鈣電流,縮短動作電位時程而實現。Anandamide亦可通過內源性大麻素2型受體途徑增加IKATP;通過非受體途徑加速Ito通道失活,減慢失活后復活,從而抑制Ito。
　　 Ⅱ內源性大麻素物質anandamide對

10、大鼠心肌缺血再灌注損傷的影響及
　　 機制
　　 目的:本實驗旨在觀察內源性大麻素物質anandamide(AEA)對大鼠心肌缺血再灌注(I-R)所致心功能損傷,梗死面積和凋亡的影響,并探討其機制。
　　 方法:應用Langendorff灌注技術,給予離體心臟30 min缺血/180 min再灌注處理,期間觀察左心室功能的變化;再灌注結束后,通過氯化三苯基四氮唑染色法測定心肌梗死面積;通過TUNEL和流式細胞技術

11、檢測細胞凋亡;利用激光共聚焦技術觀察心室肌細胞內游離鈣濃度,[Ca2+]i用相對熒光強度((FI-FI0)/FI0,％)表示。
　　 結果:
　　 (1)應用anandamide(1、10、100 nM)可濃度依賴性地促進大鼠I-R后心功能的恢復,減少梗死面積。線粒體通透性轉換孔開放劑蒼術苷(Atr,20/μM)、內源性大麻素1型受體阻斷劑AM251(1μM)、內源性大麻素2型受體阻斷劑AM630(1μM)都可以完全阻斷

12、anandamide對I-R所致心功能損傷的保護作用。
　　 (2)應用anandamide后TUNEL染色的心肌凋亡細胞數量以及流式細胞術測定的心肌細胞凋亡率都明顯降低。與缺血再灌注組比較,應用anandamide后心肌Bax蛋白表達明顯降低,而心肌Bcl-2蛋白表達和Bcl-2/Bax比率明顯升高。線粒體通透性轉換孔開放劑蒼術苷(Atr,20μM)、內源性大麻素1型受體阻斷劑AM251(1μM)、內源性大麻素2型受體阻斷劑A

13、M630(1μM)都可以完全阻斷anandamide對I-R所致凋亡的減少作用。
　　 (3)在正常臺式液、無鈣臺式液以及模擬缺血液中,anandamide(1、10、100 nM)濃度依賴性地降低細胞內游離鈣濃度。在正常臺式液中,內源性大麻素1型受體阻斷劑AM251(100 nM)可抑制anandamide(100nM)降低細胞內鈣濃度的效應,而內源性大麻素2型受體阻斷劑AM630(100 nm)對anandamide(100

14、 nM)降低細胞內鈣效應無影響。在模擬缺血液中,AM630(100 nM)可抑制anandamide降低細胞內鈣效應,而AM251(100 nM)對anandamide(100 nM)降低細胞內鈣效應無影響。在正常臺式液中,anandamide(100 nM)可抑制由L型Ca+通道激動劑Bay K8644所致細胞內鈣濃度的升高。在無鈣臺式液中,anandamide(100nM)可抑制由ryanodine所致的細胞內鈣濃度的升高。