雙酚A影響大鼠雄性子代腦多巴胺神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育和功能的機理研究.pdf

1、目的： 多項動物實驗行為檢測結果表明，腦發(fā)育期暴露于雙酚A可影響與腦多巴胺系統(tǒng)有關的行為如多動癥等，而導致這些行為改變的機理目前還不清楚。本研究分別采用原代培養(yǎng)的胎鼠腦多巴胺神經(jīng)元和圍生期雙酚A暴露的動物模型，從基因、細胞和整體動物水平探討雙酚A影響大鼠雄性子代腦多巴胺神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育和功能的機理。 方法： 第一部分體外實驗：用原代培養(yǎng)的胎鼠腦多巴胺神經(jīng)元探討雙酚A對神經(jīng)細胞的損傷機制。 1．建立胎鼠腦多巴胺

2、神經(jīng)元無血清體外培養(yǎng)模型：取孕14-15天SD大鼠的胎仔，以DMEM／F1.2含血清培養(yǎng)基接種，體外培養(yǎng)1天后換為Neurobasal+B27的無血清培養(yǎng)基，以后隔日換液。分別于體外培養(yǎng)第4天和第7天時用GFAP、NSE、TH免疫組化鑒定細胞類型、神經(jīng)細胞純度和其中多巴胺神經(jīng)元的比例；經(jīng)多次實驗后使操作過程、培養(yǎng)條件和多巴胺神經(jīng)元的比例達到穩(wěn)定。 2．用MTT試驗探討雙酚A對神經(jīng)細胞的毒性作用和確定進一步實驗采用的劑量范圍；

3、 3．雙酚A對神經(jīng)細胞的氧化損傷作用檢測：細胞于體外分別培養(yǎng)4天和7天后，分別加入0，1，10，25，50，100μM雙酚A，繼續(xù)培養(yǎng)24h和48h后，采用細胞內活性氧檢測的分子探針(DCFH-DA)檢測細胞內活性氧，用SOD、GSH和MDA試劑盒檢測細胞抗氧化酶和脂質過氧化物水平。 4．檢測雙酚A對神經(jīng)細胞凋亡的影響和對多巴胺神經(jīng)元的特異損傷作用：用彗星實驗定性檢測、流式細胞儀定量檢測雙酚A引起的神經(jīng)細胞凋亡；用酪氨酸羥化

4、酶免疫組化方法計數(shù)不同劑量雙酚A作用下的多巴胺神經(jīng)元比例的變化。 第二部分體內實驗：圍生期雙酚A暴露對出生后雄性子代大鼠腦多巴胺神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育影響的研究。 SD孕鼠自E10天至出生后21天(PND21)仔鼠斷乳止每日對母鼠灌胃染毒，分為50mg、5mg、0.5mgBPA／kg·BW劑量組及對照組。分別進行下列實驗： 1．每日定時觀察記錄各組母鼠在仔鼠出生后早期(PNDO至開眼時PNDl5)期間對仔鼠的看護及哺乳情況

5、，記錄子代雄鼠的生長發(fā)育一般狀況；并分別于仔鼠出生后第5、15、21、30和45天取雄性仔鼠腦，矢狀面一分為二，一半進行組織病理固定，另一半于液氮中保存?zhèn)溆谩?2．上述標本中取15、21、30和45天的樣品進行HE染色，于光鏡下觀察雄性仔鼠中腦區(qū)的常規(guī)組織病理學改變； 3．取第5、15、21、30和45天標本，采用免疫組化檢測雙酚A暴露對雄性子鼠腹側中腦區(qū)與凋亡有關的caspase-3、bcl-2蛋白表達的影響，用TUN

6、EL檢測出生后21天和30天雄鼠腹側中腦區(qū)神經(jīng)細胞的凋亡。 4．取第5、15、21、30和45天取雄性仔鼠腦，免疫組化檢測雙酚A暴露對腹側中腦區(qū)Nurrl和TH蛋白表達的影響。 5．采用熒光定量RT-PCR方法檢測雙酚A暴露對出生后21天、30天的雄性子鼠腦Nurrl、TH及DAT mRNA表達的影響。 結果： 一、體外實驗結果 1．原代培養(yǎng)的神經(jīng)細胞在無血清培養(yǎng)基內生長狀態(tài)良好，細胞逐漸長大、伸

7、出突觸并逐漸相互連結成網(wǎng)絡，10天以內細胞處于生長旺盛期并逐漸成熟，細胞間網(wǎng)絡連接增加，此后細胞生長狀況逐漸穩(wěn)定。細胞在體外存活時間可達30天以上。分別于體外培養(yǎng)4或7天后經(jīng)免疫組化鑒定其中TH<'+>(多巴胺神經(jīng)元)細胞比例可達到3～5％左右，而且神經(jīng)細胞占其中的絕大多數(shù)，膠質細胞的比例僅在1～2％左右，達到以往相關文獻中細胞的培養(yǎng)條件，表明可以用于進一步的實驗； 2．MTT實驗結果表明，雙酚A在10<'-8>M(1pM)至1

8、0μM以下時對神經(jīng)細胞活性基本沒有影響，在25μM時細胞存活開始出現(xiàn)明顯降低，25μM～400～μM之間細胞存活率隨雙酚A濃度增加而降低，呈現(xiàn)劑量反應關系。因此確定采用1～100μM劑量進行后續(xù)實驗； 3．細胞內活性氧檢測結果表明，在1～100μM范圍內，雙酚A可使體外培養(yǎng)第4d和第7d的細胞內活性氧水平隨劑量增加而顯著升高，25μM以上時可使細胞內抗氧化酶SOD、GSH水平降低，使脂質過氧化物MDA水平顯著增加； 4．

9、彗星實驗結果表明雙酚A在25，50和100μM時可使細胞出現(xiàn)明顯凋亡，流式細胞儀檢測結果表明DIV4時雙酚A濃度在25μM以上時可使細胞凋亡明顯增加，呈現(xiàn)劑量反應關系；酪氨酸羥化酶免疫組化結果顯示，雙酚A在10μM以上時就可使17-1<'+>細胞比例明顯降低，表明多巴胺神經(jīng)元對雙酚A的毒性作用更敏感。 體外實驗結果表明雙酚A能使細胞內活性氧明顯增加，抗氧化能力顯著降低，主要通過氧化應激損傷神經(jīng)細胞，且多巴胺神經(jīng)元對雙酚A的氧化損

10、傷作用更敏感。 二、體內實驗結果 1．可定性觀察到暴露于中(5mg/kg.BW)、高劑量組(50mg／kg.BW)雙酚A的母鼠對出生后早期的仔鼠照看行為改變，表現(xiàn)為哺乳減少，出巢時間延長。 2．組織病理學檢測結果表明，在仔鼠出生后30d(PNDl5，21，30)內，中、高劑量組雄性仔鼠腹側中腦區(qū)存在較多胞體呈圓形，胞核深染，胞質濃縮的異常細胞，并可見該區(qū)域細胞排列疏松，細胞數(shù)減少； 3．免疫組化結果顯示

11、在仔鼠出生后5～30天(PND5，15，21，30)時，高、中劑量組雄鼠腦腹側中腦區(qū)caspase-3表達與對照組相比均顯著增加，bcl-2表達均顯著降低，低劑量組和對照組相比無顯著差異，出生后45天時，各組間無顯著差異。TUNEL檢測結果顯示，在PND21和PND30時的子代雄鼠腦的同一區(qū)域，中、高劑量組凋亡細胞明顯增加。 4．TH和Nurrl免疫組化結果顯示在出生后5-45天(PND5，15，21，30，45)時，高、中劑量

12、組雄鼠腦腹側中腦區(qū)TH和Nurrl表達與對照組相比均顯著降低。TH表達降低表明BPA暴露使子代腹側中腦區(qū)多巴胺神經(jīng)元減少。 5．熒光定量RT-PCR結果顯示，在高、中劑量染毒組，出生后21，30天的雄鼠腦Nurr1、TH和DAT mRNA表達與對照組相比均顯著降低。 結論： 1．雙酚A可通過活性氧產生氧化應激損傷體外培養(yǎng)的多巴胺神經(jīng)元，導致細胞凋亡； 2．圍生期雙酚A暴露可通過caspase-3途徑導致子

13、代雄鼠中腦區(qū)神經(jīng)細胞凋亡增加，同時使中腦區(qū)酪氨酸羥化酶表達降低，即圍生期雙酚A暴露可造成中腦多巴胺神經(jīng)元減少，從而可使多巴胺神經(jīng)遞質合成減少； 3．圍生期雙酚A暴露可降低與多巴胺神經(jīng)元發(fā)育和功能維持的重要基因Nurrl及其蛋白的表達降低，同時也使TH和DAT基因表達降低。由于這三種基因都是維持多巴胺神經(jīng)元功能的重要基因，它們表達的改變必然會引起子代與多巴胺系統(tǒng)有關的行為改變。 綜合體外和體內的研究結果表明，子代雄鼠腦發(fā)育