DMD病人特異性iPSCs誘導(dǎo)及hESCs向限定性內(nèi)胚層細(xì)胞分化的研究.pdf

1、胚胎干細(xì)胞（embryonic stem cells，ESCs）和誘導(dǎo)多潛能性干細(xì)胞(induced pluripotent stem cells，iPSCs)為基因修飾以及基因治療提供了一種新型的研究工具。將基因修正后的人類多潛能性干細(xì)胞細(xì)胞經(jīng)過自體移植，可實(shí)現(xiàn)某些遺傳疾病治療的目的。我室一直致力于杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良(DMD)及血友病A的基因治療研究。作為基因治療的靶細(xì)胞，解決iPS細(xì)胞的來(lái)源是進(jìn)行后續(xù)研究得以順利開展的基礎(chǔ)。本研究第一章

2、內(nèi)容擬將病人來(lái)源的尿液細(xì)胞誘導(dǎo)為iPS細(xì)胞，為后續(xù)DMD病人的自體化基因治療提供合適的細(xì)胞來(lái)源。第二章研究?jī)?nèi)容擬利用我室之前建立的定點(diǎn)整合hFⅧ的人胚胎干細(xì)胞細(xì)胞株ET5作為研究對(duì)象，初步建立hESCs向限定性內(nèi)胚層細(xì)胞(Definitive endoderm cells，DECs)分化的技術(shù)平臺(tái)，從而為后續(xù)血友病A的治療中肝細(xì)胞的來(lái)源提供一種解決思路。
　　第一章:DMD病人尿液細(xì)胞向iPSCs的誘導(dǎo)與初步鑒定。
　　目的

3、:利用DMD病人尿液來(lái)源的細(xì)胞獲得病人特異性iPSCs。
　　方法:1.收集DMD基因50號(hào)外顯子缺失的DMD病人尿液，分離并培養(yǎng)尿液細(xì)胞中腎小管上皮細(xì)胞。
　　2.利用逆轉(zhuǎn)錄病毒將Oct4，Sox2，c-Myc和Klf4四種轉(zhuǎn)錄因子導(dǎo)入尿液細(xì)胞，經(jīng)過20天左右的誘導(dǎo)，獲得形態(tài)與hESCs細(xì)胞系高度相似的細(xì)胞克隆。
　　3.對(duì)所得的細(xì)胞克隆進(jìn)行多潛能性干細(xì)胞的表面標(biāo)志物、堿性磷酸酶、細(xì)胞核型及體外隨機(jī)分化的鑒定。

4、>　　結(jié)果:1.經(jīng)上述方法誘導(dǎo)可獲得尿液細(xì)胞來(lái)源的iPSCs樣細(xì)胞系，MLPA檢測(cè)誘導(dǎo)后iPSCs基因組DMD基因50號(hào)外顯子缺失;
　　2.誘導(dǎo)iPSCs細(xì)胞堿性磷酸酶染色陽(yáng)性，且干細(xì)胞表面標(biāo)志物表達(dá)與hESCs一致;細(xì)胞染色體核型顯示無(wú)染色體水平的畸變;體外EB形成檢測(cè)誘導(dǎo)的iPSCs可分化出表達(dá)內(nèi)、中胚層特異標(biāo)志物的細(xì)胞。
　　結(jié)論:建立了DMD基因50號(hào)外顯子缺失的iPS細(xì)胞系。
　　第二章:hESCs向限定性

5、內(nèi)胚層細(xì)胞的誘導(dǎo)分化。
　　目的:初步建立hESCs定向限定性內(nèi)胚層細(xì)胞誘導(dǎo)分化以及鑒定的技術(shù)平臺(tái)。
　　方法:1.聯(lián)合BMP4、Activin A、chir99021誘導(dǎo)ET5向限定性內(nèi)胚層細(xì)胞分化;
　　2.分化過程的第一天和第五天抽提分化細(xì)胞的RNA，RT-PCR檢測(cè)內(nèi)胚層標(biāo)志基因Sox17，F(xiàn)oxA2的表達(dá)情況;
　　3.分化五天后流式分析DE細(xì)胞表面特異標(biāo)志物c-kit(CD117)、CXCR4(CD1

6、84)的表達(dá)。
　　結(jié)果:1.聯(lián)合高濃度Activin A、BMP4、chir99021對(duì)ET5誘導(dǎo)5天，分化第二天即可在ET5克隆中觀察到上皮樣細(xì)胞的出現(xiàn)。
　　2.分別抽提分化過程當(dāng)中第一天和第五天的細(xì)胞的RNA，RT-PCR分析可檢測(cè)到Sox17，F(xiàn)oxA2的表達(dá)。
　　3.誘導(dǎo)五天后，流式分析DE細(xì)胞表面共表達(dá)c-kit、CXCR4陽(yáng)性率達(dá)到39.01％。
　　結(jié)論:初步建立hESCs向限定性內(nèi)胚層細(xì)胞分