IL-6預(yù)處理上調(diào)PHB表達保護H2O2致心肌細胞損傷作用機制.pdf

1、一、目的
　　 近年來,國內(nèi)外大量研究文獻都表明氧化應(yīng)激是許多病理因素造成心血管損傷的共同機制,在許多心血管疾病的病理過程中都有過量氧自由基產(chǎn)生,同時抗氧自由基防御機制卻受到抑制,如動脈粥樣硬化(AS)、高血壓病、缺血性心臟病、高脂血癥等。氧化應(yīng)激損傷心肌細胞的轉(zhuǎn)歸與氧化應(yīng)激的程度相關(guān),在一定應(yīng)激強度范圍內(nèi),氧化應(yīng)激對心肌細胞造成的損傷是可逆的,而超過一定限度,則對心肌細胞造成不可逆的損傷,主要包括心肌細胞的凋亡和壞死。

2、　　 Prohibitin又稱抗增殖蛋白,最初發(fā)現(xiàn)于1991年,是核基因編碼的蛋白質(zhì),主要存在于線粒體和細胞核內(nèi)。近期的研究發(fā)現(xiàn),prohibitin蛋白參與了心肌IR及氧化應(yīng)激的病理過程,并且其在氧化應(yīng)激過程中通過穩(wěn)定線粒體結(jié)構(gòu),維持線粒體內(nèi)膜完整性從而發(fā)揮其減少心肌細胞凋亡,保護心肌細胞的作用。并且,還有學(xué)者通過在腸上皮細胞中的研究發(fā)現(xiàn),IL-6可能是prohibitin蛋白的上游調(diào)控因子,通過轉(zhuǎn)錄信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子與激活子(signal

3、 transducer and activator 0ftranscription 3,STAT3)這條細胞信號通路實現(xiàn)對其表達調(diào)控。
　　 因此,我們推測在體外培養(yǎng)的心肌細胞中,給予一定量的IL-6預(yù)處理也可能通過增加prohibitin的表達減輕H2O2導(dǎo)致的心肌細胞氧化應(yīng)激損傷。因此,我們擬采用在正常體外培養(yǎng)的乳鼠心肌細胞中加入一定量的IL-6干預(yù),通過實時熒光定量PCR法及Western blot法檢驗心肌細胞中proh

4、ibitin mRNA及蛋白的表達情況。通過SiRNA干擾技術(shù)(small interfering RNA,SiRNA)沉默prohibitin基因,檢測氧化應(yīng)激心肌細胞活力及凋亡等情況,以便進一步明確prohibitin蛋白在氧化應(yīng)激心肌細胞中的作用,初步探討IL-6預(yù)處理保護氧化應(yīng)激心肌細胞損傷的部分分子機制。
　　 二、方法
　　 1.乳鼠心肌細胞的原代培養(yǎng) 參照Paul Simpson方法稍加改進,外科無菌條件下

5、取出乳鼠心臟,用胰酶逐步消化法分離單個心肌細胞,接種至培養(yǎng)瓶中,采取差速貼壁分離法以去除心肌成纖維細胞,得到純度較高的心肌細胞用于實驗。
　　 2.H2O2致心肌細胞氧化應(yīng)激模型建立 心肌細胞正常培養(yǎng)3天后,選取細胞密度在95％以上的,自律性搏動120～140次/min的心肌細胞用于實驗,選取不同濃度與時間點的H2O2干預(yù)心肌細胞,選擇合適的濃度及干預(yù)時間用于后面的實驗。
　　 3.MTT比色法測定心肌細胞活力 將心肌細

6、胞接種于九十六孔板,按實驗分組給予相應(yīng)的處理因素后,按MTT法具體操作步驟進行處理,在酶標(biāo)儀490nm處測其OD值并計算各組心肌細胞存活率。
　　 4.流式細胞儀(FCM)檢測心肌細胞凋亡率 心肌細胞按照實驗分組處理后,用不含EDTA的胰酶消化收集,以Annexin V-FITC/Propidium Iodide進行染色,室溫、避光、反應(yīng)5～15min,再上流式細胞儀(激發(fā)波長488nm,發(fā)射波長530nm)進行檢測。
　

7、　 5.凋亡細胞形態(tài)學(xué)觀察 心肌細胞按實驗分組處理后,按照Heochst33342/PI雙染試劑盒說明說進行染色,在倒置熒光顯微鏡下觀察凋亡細胞及壞死細胞形態(tài)并拍照。Heochst 33342產(chǎn)生蘭色熒光,PI產(chǎn)生紅色熒光。
　　 6.心肌細胞GSH的檢測 將心肌細胞接種于六孔培養(yǎng)板中,實驗分為正常對照組、H2O2組、IL-6預(yù)處理+H2O2組,其中IL-6預(yù)處理的濃度分別為1、5、10、50、100ng/mL共7組,處理完畢

8、后,按照谷胱甘肽GSH(除蛋白)檢測試劑盒說明書進行操作,在酶標(biāo)儀420nm處測量每組OD值并計算各組細胞內(nèi)GSH的含量。實驗重復(fù)三次以上。計算公式:GSH含量(gGSH/L)=(測定管吸光度-空白管吸光度)×標(biāo)準(zhǔn)管濃度(20μmol/L)×GSH分子量(307)×稀釋倍數(shù)/(標(biāo)準(zhǔn)管吸光度-空白管吸光度)。
　　 7.SiRNA沉默心肌細胞PHB基因 調(diào)合適的細胞濃度分別接種于六孔板或九十六孔板中,正常培養(yǎng)3天左右,當(dāng)貼璧細胞達

9、到80％～90％融合時,取細胞進行實驗。實驗共分為6組:正常對照組、H2O2組、H2O2+IL-6組、H2O2+IL-6+陰性轉(zhuǎn)染組、SiRNA轉(zhuǎn)染組和H2O2+IL-6+SiRNA轉(zhuǎn)染組。具體方法見Santa CruzSiRNA轉(zhuǎn)染試劑盒說明。轉(zhuǎn)染心肌細胞48～72h后收集細胞,再進行Westernblot實驗和MTT檢測心肌細胞活力。
　　 8.實時定量PCR檢測心肌細胞內(nèi)PHB mRNA的表達心肌細胞按照2×107/孔的濃

10、度接種至六孔板中,取正常培養(yǎng)3天后狀態(tài)最佳的心肌細胞用于實驗。實驗分組依次為:正常對照組、IL-61、5、10、50、100 ng/mL五個濃度組,IL-6干預(yù)心肌細胞8h后,用Trizol提取心肌細胞總RNA,在紫外分光光度計上測定OD260/OD280,鑒定提取的RNA純度和濃度。然后,反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,根據(jù)Gene Bank中PHB、GAPDH的基因序列資料,借助于計算機軟件PrimerPremier5.0設(shè)計引物,上機進行目的

11、基因的熒光定量檢測。
　　 9.Western blot法檢測心肌細胞PHB蛋白的表達 心肌細胞按實驗分組處理完成后,以Western及IP細胞裂解液提取心肌細胞蛋白,BCA法進行蛋白定量,進行蛋白印跡實驗。以GAPDH為內(nèi)參,將處理好的蛋白質(zhì)樣品進行SDS-PAGE分離,電泳結(jié)束后將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上,封閉后,孵育一抗和二抗,ECL 顯色,KODAK Image Station 2000MM成像系統(tǒng)采集圖像,獲得圖像用圖

12、像處理軟件Image Tool 3.0測定并分析條帶灰度值以檢測PHB的表達水平。
　　 三、結(jié)論
　　 1.H2O2能明顯抑制心肌細胞活力,促進心肌細胞凋亡的發(fā)生；
　　 2.低濃度的IL-6預(yù)處理心肌細胞可顯著減輕H2O2致心肌細胞損傷,表現(xiàn)在增加心肌細胞活力和降低細胞凋亡率兩方面；
　　 3.低濃度IL-6預(yù)處理心肌細胞可明顯上調(diào)心肌細胞GSH表達水平,從而減輕心肌細胞氧化應(yīng)激損傷；