應(yīng)用RNA干擾技術(shù)抑制膽囊癌survivin基因表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、第一部分 膽囊癌中survivin的表達(dá)及其與CD44v6和nm23、VEGF基因表達(dá)的關(guān)系及其臨床價(jià)值 目的探討膽囊癌中survivin、CD44v6和nm23、VEGF基因表達(dá)的相關(guān)性及其臨床意義。方法采集膽囊癌標(biāo)本及其病例資料，采用免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測(cè)39例膽囊癌標(biāo)本survivin、CD44v6和nm23、VEGF的表達(dá)。統(tǒng)計(jì)分析survivin、CD44v6和nm23、VEGF在膽囊癌組織中表達(dá)的相關(guān)性和sur

2、vivin、CD44v6和nm23、VEGF在膽囊癌表達(dá)與病例臨床特征之間的相關(guān)性。結(jié)果膽囊癌中26例survivin表達(dá)陽(yáng)性，陽(yáng)性率為66.7％。22例CD44v6表達(dá)陽(yáng)性，陽(yáng)性率為56.4％。15例nm23表達(dá)陽(yáng)性，陽(yáng)性率為38.5％。膽囊癌組織survivin與CD44v6的表達(dá)陽(yáng)性率高于癌旁組織及膽囊腺瘤性息肉組織組織(P＜0.05)。CD44v6、nm23的表達(dá)與膽囊癌腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)(P＜0.05)。相關(guān)性檢驗(yàn)示survivin

3、、CD44v6和nm23之間有相關(guān)性。24例VEGF表達(dá)陽(yáng)性，陽(yáng)性率為61.5％。膽囊癌組織survivin與VEGF的表達(dá)陽(yáng)性率高于癌旁組織及膽囊腺瘤性息肉組織組織(P＜0.05)。VEGF的表達(dá)與膽囊癌腫瘤轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)(P＜0.01)。相關(guān)性檢驗(yàn)示survivin與VEGF之間有相關(guān)性(x2=4.388，P＜0.05)。結(jié)論survivin在膽囊癌中的表達(dá)能促進(jìn)膽囊癌的發(fā)生發(fā)展。膽囊癌中survivin、CD44v6和VEGF蛋白表

4、達(dá)均上調(diào)，共同參與膽囊癌發(fā)生和發(fā)展，CD44v6、VEGF與survivin、nm23有協(xié)同表達(dá)關(guān)系。 第二部分 膽囊癌GBC-SD細(xì)胞經(jīng)順鉑處理survivin的表達(dá)及意義 目的探討經(jīng)順鉑(DDP)處理膽囊癌細(xì)胞后survivin表達(dá)及其與腫瘤細(xì)胞耐藥之間的關(guān)系。方法采用MTT比色法測(cè)定膽囊癌細(xì)胞對(duì)4種化療藥物的敏感性。RT-PCR檢測(cè)survivinmRNA的表達(dá)。Westernblot檢測(cè)survivin蛋

5、白表達(dá)的變化。結(jié)果GBC-SD細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性從高到低依次為DDP＞ADM＞5-FU＞MMC。化學(xué)藥物處理后的第1天，3組膽囊癌細(xì)胞的survivinmRNA表達(dá)水平均降低；其中0.5μg/mlDDP+GBC-SD組下降了10％，3μg/mlDDP+GBC-SD組下降36％，6μg/mlDDP+GBC-SD組下降了28％。第3天，0.5μg/mlDDP組和3μg/mlDDP組GBC-SD細(xì)胞的survivinmRNA表達(dá)與第1天比

6、較，分別上升22％和64％，但6μg/mlDDP組仍持續(xù)降低，僅為第1天的66％。0.5μg/mlDDP組和3μg/mlDDP組作用3天后的GBC-SD細(xì)胞中survivin蛋白含量分別升高了15％和12％，而6μg/mlDDP組則下降了80％。結(jié)論低濃度的DDP即能誘導(dǎo)膽囊癌細(xì)胞內(nèi)survivin的表達(dá)增加，這可能是膽囊癌細(xì)胞對(duì)化療藥物產(chǎn)生耐藥性的因素之一。 第三部分 survivinshRNA表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建、轉(zhuǎn)染和篩

7、選 目的構(gòu)建針對(duì)survivin基因的短發(fā)夾環(huán)RNA(shRNA)的真核表達(dá)載體，并篩選出穩(wěn)定表達(dá)survivinshRNA的GBC-SD細(xì)胞。方法設(shè)計(jì)、合成包含BbsI酶切位點(diǎn)的針對(duì)survivin的shRNA，與BbsI酶切后真核表達(dá)載體pEGFP-H1連接，將其定向克隆至H1啟動(dòng)子下，構(gòu)建成重組載體pEGFP-survivin；采用脂質(zhì)體法將pEGFP-H1和重組質(zhì)粒導(dǎo)入到GBC-SD細(xì)胞中，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率；用G

8、418對(duì)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞進(jìn)行穩(wěn)定篩選。結(jié)果酶切分析和測(cè)序證實(shí)pEGFP-survivin構(gòu)建成功；pEGFP-H1與pEGFP-survivin在GBC-SD細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染效率分別為(80.29±2.71)％和(83.85±2.34)％(P＞0.05)。通過(guò)G418篩選獲得了穩(wěn)定表達(dá)的GBC-SD細(xì)胞株，分別命名為GBC-SD/EGFP和GBC-SD/survivin。結(jié)論成功構(gòu)建了針對(duì)survivin基因的shRNA真核表達(dá)載體，并獲得了穩(wěn)定

9、表達(dá)survivinshRNA的細(xì)胞株GBC-SD/survivin。 第四部分 pEGFP-survivin對(duì)GBC-SD細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制及對(duì)化療敏感性的影響 目的觀(guān)察pEGFP-survivin對(duì)GBC-SD細(xì)胞化療敏感性的影響。方法以MTT法檢測(cè)GBC-SD、GBC-SD/EGFP和GBC-SD/survivin三種細(xì)胞的增殖活性；用RT-PCR和WesternBlot測(cè)各組細(xì)胞中survivinmRNA和蛋

10、白質(zhì)水平的表達(dá)；以合適濃度的DDP作用相同的時(shí)間后，用MTT法檢測(cè)三種細(xì)胞存活率，流式細(xì)胞儀測(cè)細(xì)胞凋亡，并用MTT法篩選IC50值，TUNEL法觀(guān)察細(xì)胞核改變；另外檢測(cè)DDP作用后各組細(xì)胞的caspase-3蛋白酶活性的變化。結(jié)果GBC-SD和GBC-SD/EGFP細(xì)胞的增殖活性大致相同，而GBC-SD/survivin細(xì)胞的增殖活性則明顯下降；RT-PCR和WesternBlot均發(fā)現(xiàn)GBC-SD/survivin細(xì)胞中的surviv

11、in表達(dá)水平較其余兩種細(xì)胞明顯下降；在給與了DDP作用后，GBC-SD/survivin細(xì)胞存活率和IC50明顯較低，細(xì)胞凋亡率較高，而三種細(xì)胞用TUNEL法染色后均可見(jiàn)棕色凋亡細(xì)胞核。給與了DDP作用后，各組細(xì)胞Caspase-3活性均呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢(shì)，但GBC-SD/survivin細(xì)胞中Caspase-3的活性明顯高于另外兩種細(xì)胞。結(jié)論pEGFP-survivin表達(dá)的survivinshRNA能明顯降低GBC-SD細(xì)胞中s