IL-1β、HIF-α和VEGF在兔骨性關節(jié)炎模型的滑膜中的表達.pdf

1、骨性關節(jié)炎是中老年人最常見的疾病之一，由于人群預期壽命的延長，骨性關節(jié)炎的發(fā)病率也明顯增高，尤其是肥胖的老年人群，60歲以上人群中，50％以上在X線上有骨性關節(jié)炎表現。其常見病理改變?yōu)檐浌窍鹿怯不?、關節(jié)周圍骨贅形成、慢性滑膜炎，其引起的疼痛、功能障礙嚴重影響患者的生活質量。健康的軟骨組織是一種無血管、神經、淋巴管的結締組織，關節(jié)軟骨的營養(yǎng)及供氧主要通過關節(jié)滑液及軟骨下骨中取得。而整個關節(jié)是處于一種生理性低氧環(huán)境之中。既往研究顯示關節(jié)滑液

2、中的氧分壓僅為6.65-7.98Kpa，表層軟骨含氧量為7％-10％，隨著深度增大這種缺氧不斷增加，深層軟骨含氧量僅為1％。正常情況下，這種低氧環(huán)境對關節(jié)軟骨的正常生理功能具有重要意義。骨性關節(jié)炎病變時，某些細胞因子及蛋白如TNF-a，IL-1，IL-17促進滑膜成纖維細胞的增生，導致滑膜增殖，當滑膜組織的增殖速度超過想對應的血管增生的速度，以及關節(jié)腔內壓力升高進一步減少關節(jié)腔內的供血，導致滑膜關節(jié)內缺氧會進一步加重，yudoh k及他

3、的同事研究發(fā)現，這時的軟骨表面的氧含量為3％-8％，在缺氧加重的條件下，許多種細胞內PHD-2、PHD-3顯著增加，從而促進低氧誘導因子(HIF-1)基因表達增加。
　　 HIF-1是一種在缺氧狀態(tài)下發(fā)揮作用的核轉錄因子(NF)，是在進行低氧誘導的紅細胞生成素(EPO)基因表達的研究時發(fā)現的一種DNA結合蛋白。它是由HIF-1α和HIF-1β構成的異源二聚體，HIF-1α是bHLH-PAS蛋白家族中的一員，由于其結構中較HIF-

4、1β多了一個氧依賴降解區(qū)域(ODD)，因此HIF-1β是HIF-1調節(jié)缺氧中特有亞基。關節(jié)缺氧情況加重時，細胞漿內堆積的HIF-1α轉移至核內，并與血管內皮生長因子(VEGF)DNA結合導致VEGF表達增高，VEGF是目前公認的一種促血管生成的因子，它導致內皮細胞增殖及遷移，或者通過環(huán)氧化酶-2(cox-2)等直接導致血管增生。在血管內皮生長因子發(fā)揮作用的同時，β-神經生長因子、神經肽同時發(fā)揮它們促神經生長的作用，這些新生的神經是沿著血

5、管而生長，最終與新生血管一起，插入未骨化的軟骨、半月板以及新生的骨贅之中。新生的血管雖然在某種程度上改善了關節(jié)中的供氧，但卻同時促進了滑膜炎癥的浸潤，而新生的神經可能加重骨性關節(jié)炎的疼痛癥狀。
　　 既往對于骨性關節(jié)炎的研究，主要是針對軟骨及軟骨下骨。近年來，人們發(fā)現慢性滑膜炎在骨性關節(jié)炎的發(fā)病機制中具有重要作用。在取行關節(jié)鏡手術及關節(jié)置換的骨性關節(jié)炎患者的滑膜組織進行病理檢查發(fā)現，骨性關節(jié)炎患者從發(fā)病早期到必須行關節(jié)置換手術的

6、疾病晚期都伴隨有慢性滑膜炎改變。滑膜炎發(fā)生時，滑膜細胞分泌多種促炎因子和細胞因子，介導下游因子參與軟骨的破壞作用，IL-1β是這一過程中最重要的炎癥因子之一，在骨性關節(jié)炎的發(fā)病過程中具有重要作用，它主要由CD14+滑膜巨噬細胞產生，能夠促進軟骨細胞及滑膜細胞分泌PGE2（前列腺素E2）及其他炎癥介質，進一步促進滑膜炎癥，誘導骨吸收。IL-1β加入體外培養(yǎng)的軟骨細胞中，可激活誘導型NO合成酶(iNOS)產生大量的NO，NO作為IL-1β的

7、下游產物，是IL-1β作用于軟骨的主要效應分子，IL-1β從Fas途徑對軟骨細胞凋亡產生明顯影響。IL-1β與TNF-α能與各自的細胞表面受體結合，激活炎癥信號通路，最終激活核因子κB(NF-κB)，NF-κB是一種轉錄因子，可以由壓力有關的刺激，包括過度的機械應力和ECM的降解產物。一旦被激活，NF-κB的調節(jié)許多細胞因子，趨化因子，粘附分子，炎癥介質，和幾個基質降解酶MMPs的表達。MMPs是酶活性依賴鋅離子的蛋白酶超家族，廣泛存在

8、于結締組織中，對軟骨細胞外基質成分中的Ⅱ型膠原蛋白及蛋白聚糖具有高度的裂解活性，既往研究顯示，IL-1β能促進MMP-13、3 mRNA在軟骨細胞中的表達，抑制Ⅱ型膠原蛋白及蛋白聚糖的合成，IL-1β還能促進MMP-1、3的合成代謝，通過降解Ⅱ型膠原蛋白，達到破壞關節(jié)軟骨的目的。IL-1β還能夠上調HIF-1α蛋白水平，上調下游基因VEGF的表達，促進滑膜組織中血管增殖，進而促進炎癥浸潤。
　　 本研究利用木瓜蛋白酶行兔膝關節(jié)腔

9、注射進行骨性關節(jié)炎模型制造，完成造模后切取膝關節(jié)中滑膜組織，采用ELISA方法檢測實驗性骨性關節(jié)炎滑膜中的IL-1β、VEGF表達和采用Western blot方法檢測實驗性骨性關節(jié)炎滑膜中的HIF-1α的表達，以探討IL-1β、HIF-1α、VEGF的表達與OA之間的關系。
　　 HIF-1α在兔膝關節(jié)骨性關節(jié)炎模型滑膜組織中表達
　　 研究目的:
　　 1、采用木瓜蛋白酶行兔膝關節(jié)腔注射制造兔膝關節(jié)骨性關節(jié)炎

10、模型。
　　 2、觀察造模后不同時期兔膝關節(jié)滑膜及軟骨的表現，并切取滑膜組織保存。
　　 3、采用Western blot方法檢測實驗性骨性關節(jié)炎滑膜中的HIF-1α的表達并探討其意義。
　　 材料和方法:按照實驗設計，將30只雄性新西蘭大白兔分為6組(實驗組A1、A2、A3;對照組B1、B2、B3)，每組5只，共10個膝關節(jié)。對實驗組A1、A2、A3分別于第1、4、7天以1.6％木瓜蛋白酶行膝關節(jié)腔內注射制造兔

11、膝關節(jié)骨性關節(jié)炎模型，予對照組B1、B2、B3分別于第1、4、7天以生理鹽水行膝關節(jié)腔內注射作為對照。并分別在注射完成后2周、4周、6周后使用氣體栓塞法分別處死A1B1.、A2B2、A3B3組動物，切開動物膝關節(jié)，觀察造模后2、4、6周后膝關節(jié)腔內滑膜增生及軟骨退變情況，切取膝關節(jié)滑膜組織，迅速置于液氮瓶中，并最終置于-80℃的冰箱內保存，待6周后，滑膜標本采集完畢，將滑膜組織自冰箱內取出，加入組織裂解液后迅速研磨成勻漿液，采用West

12、ern blot方法檢測實驗性骨性關節(jié)炎滑膜中的HIF-1α的表達。
　　 結果:對照組B1、B2、B3組兔膝關節(jié)無腫脹、充血，關節(jié)液透明，滑膜組織無水腫、無肥厚，關節(jié)軟骨半透明光滑，呈淡藍色;A1、A2、A3組兔膝關節(jié)腫脹、充血明顯關節(jié)液呈淡黃色渾濁狀態(tài)，A1組滑膜組織稍增厚，關節(jié)面粗糙，關節(jié)軟骨色澤狄暗，呈現骨性關節(jié)炎早期表現;A2組滑膜明顯增厚關節(jié)面軟骨色澤灰暗、潰瘍形成，呈現骨性關節(jié)炎中期表現;A3組滑膜最厚，滑膜組織與

13、股骨粘連嚴重，軟骨缺損明顯，部分軟骨剝脫軟骨下骨質暴露，呈現骨性關節(jié)炎晚期表現。模型組A1、A2、A3組滑膜中HIF-1α的表達分別與對照組B1、B2、B3組比較，A1組＞B1組、A2組＞B2組、A3組＞B3組（均P＜0.01）;模型組A1、A2、A3組滑膜中HIF-1α的表達差異有顯著性，A1組＜A2組、A2組＜A3組(均P＜0.05)。
　　 結論:造模后不同時期，兔膝關節(jié)表現出骨性關節(jié)炎早期、中期、晚期的表現，膝關節(jié)滑膜逐

14、漸增厚，HIF-1α因子表達與膝關節(jié)滑膜增殖程度呈正相關，HIF-1α的差異表達與骨性關節(jié)炎退變有關。
　　 木瓜蛋白酶IL-1β、VEGF在兔膝關節(jié)骨性關節(jié)炎模型滑膜組織中表達研究
　　 目的:
　　 1、采用木瓜蛋白酶行兔膝關節(jié)腔注射制造兔膝關節(jié)骨性關節(jié)炎模型。（與檢測HIF-1α蛋白來自相同的動物模型中）
　　 2、采用ELISA方法檢測實驗性骨性關節(jié)炎滑膜中的IL-1β、VEGF表達并探討其意義。

15、
　　 材料和方法:造模方式與檢測HIF-1α蛋白時相同，切取膝關節(jié)滑膜組織，加入緩沖液后研磨成勻漿分裝后迅速置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆?，待標本完全備齊，將冷凍的滑膜組織取出，采用ELISA方法檢測實驗性骨性關節(jié)炎滑膜中的IL-1β、VEGF表達。
　　 結果:模型組A1、A2、A3組滑膜中IL-1β、VEGF的表達分別與對照組B1、B2、B3組比較，A1組＞B1組、A2組＞B2組、A3組＞B3組（均P＜0.01）;模型組