13-甲基十四烷酸誘導膀胱癌細胞株T24凋亡及其機理研究.pdf

1、本文擬通過體外培養(yǎng)膀胱癌T24細胞株，研究13-MTD對T24細胞株增殖和凋亡的影響，探討其應用于膀胱癌預防和治療的可能性。通過對常見凋亡相關性蛋白的研究探討13-MTD促進T24細胞株凋亡的信號通路，為13-MTD的臨床應用提供基礎理論和實驗依據(jù)。 實驗材料和方法：首先通過MTT法檢測13-MTD對膀胱癌細胞株T24凋亡的生長抑制，通過TUNEL末端標記、流式細胞儀檢測細胞周期、western檢測凋亡蛋白等方法研究13-MTD

2、是否引起膀胱癌細胞株T24凋亡，在此基礎上，通過westernblot方法研究13-MTD是通過Fas受體途徑還是通過線粒體釋放細胞色素C途徑引起細胞凋亡，并進一步通過westernblot方法研究MAPK、AKT等信號途徑在13-MTD誘導膀胱癌細胞株T24凋亡中的作用。 1.細胞培養(yǎng)和實驗分組膀胱癌T24細胞株用含10％新生牛血清的Mccoy’5A培養(yǎng)基，置于5％CO2，37℃的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。 實驗分藥物處理組和

3、溶劑對照組兩個大組，分別在處理后2、8、12、24、48小時收集細胞。 2.MTT法檢測13-MTD對腫瘤細胞增殖的影響以1×104/孔接種細胞至96孔板，24小時后換含藥物的新鮮培養(yǎng)基。處理12、24小時后加MTT孵育4小時，酶標儀上檢測光密度，計算細胞活力。 3.流式細胞儀(FCM)檢測細胞周期各組細胞以70％冰乙醇，固定過夜，然后以RNA酶處理和PI染料染色，流式細胞儀進行檢測。 4.細胞凋亡TUNEL(D

4、NA切口末端標記法)分析取處理后的各組細胞爬片，多聚甲醛固定后，按照細胞凋亡檢測試劑盒(InSituCellDeathDetectionKit)說明進行操作。DAB顯色后計數(shù)細胞，計算細胞百分比。 5.蛋白免疫印跡法分析參與凋亡的蛋白將各組細胞裂解提取細胞蛋白，BCA法測定蛋白含量，等量蛋白進行SDS-PAGE電泳，然后用可能參與細胞凋亡的各種蛋白的抗體進行蛋白免疫印跡分析，ECL化學發(fā)光，曝光后進行圖像分析。 研究結(jié)果

5、： 1.MTT法檢測不同藥物濃度的13-MTD對膀胱癌細胞生長的影響與對照組相比，13-MTD對膀胱癌T24細胞株增殖抑制作用明顯，其中35ug/ml～140ug/ml的藥物濃度在12小時和24小時后均可抑制細胞增殖(P＜0.05)。相對抑制率(IR)表明13-MTD的抑制作用有時間濃度依賴效應。 2.流式細胞儀檢測細胞周期和凋亡率13-MTD處理細胞2、8、24、48小時后，隨著藥物作用時間的增加，亞二倍體峰細胞數(shù)量顯

6、著增加(P＜0.05)，48小時后細胞的凋亡率可以達到84％，但不同時間的細胞G0-G1，S期，G2/M期的DNA百分比沒有明顯的差別。 3.TUNEL法檢測細胞凋亡指數(shù)TUNEL法檢測結(jié)果經(jīng)定量分析證實細胞凋亡率差異有統(tǒng)計學意義(n=10，P=0.01)，采用LSD-t法進行藥物組和溶劑組組間比較結(jié)果顯示：藥物處理12小時較溶劑組相比較差異有顯著性[(43.2±4.6)％，(4.5±0.28)％，P＜0.01]，24小時差異更

7、加明顯[(68.2±3.8)％，(6.3±0.35)％，P＜0.01]。 4.westernblotting檢測參與13-MTD誘導膀胱癌T24細胞凋亡的蛋白和信號通路藥物處理后細胞內(nèi)bcl-2蛋白量降低，bax含量升高，線粒體中細胞色素C釋放，caspase酶底物PARP、LaminB、RB在12小時出現(xiàn)明顯的裂解片段，2小時后P38和JNK磷酸化開始升高，AKT磷酸化下降，F(xiàn)ADD及磷酸化FADD沒有明顯變化，c-myc、P

8、21沒有變化。 研究結(jié)論： 1.13-MTD可以誘導膀胱癌細胞株T24細胞凋亡，并且具有時間依賴性和濃度依賴性。 2.13-MTD能夠調(diào)節(jié)Bcl-2超家族中的Bcl-2蛋白和bax蛋白含量，激活線粒體凋亡途徑，使線粒體內(nèi)的細胞色素C釋放到胞漿，激活Caspase酶，裂解相應的凋亡底物LaminB、Rb、PARP，促進T24細胞凋亡。 3.在13-MTD誘導膀胱癌細胞株T24細胞凋亡的過程中P38MAPK信