抗幽門(mén)螺桿菌UreB及HpaA抗原單抗的制備及臨床應(yīng)用探索.pdf

1、目的：幽門(mén)螺桿菌(Helicobacterpylori，Hp)是一種定植于胃內(nèi)的革蘭氏染色陰性、螺桿狀、微需氧菌，目前全球近50％的人口感染了Hp，在發(fā)展中國(guó)家，其感染率可達(dá)到70％以上。因此，建立無(wú)創(chuàng)、便捷、廉價(jià)的檢測(cè)方法對(duì)Hp的早期診斷具有重要的應(yīng)用價(jià)值。目前，Hp的診斷方法主要有侵入性和非侵入性，非侵入性因?yàn)榱己玫牟∪艘缽男远妒芮嗖A。而非侵入性方法中，血清學(xué)實(shí)驗(yàn)在年輕患者中準(zhǔn)確性不高，而13C尿素呼吸實(shí)驗(yàn)很昂貴，因而有必要尋找一

2、種準(zhǔn)確性高、無(wú)創(chuàng)、簡(jiǎn)便、價(jià)廉的診斷Hp感染的新方法。由于Hp是經(jīng)糞-口傳播，因此，以ELISA方法檢測(cè)糞便中Hp抗原(HpyloristoolantigenEIA，HpSA)就成為可能。自從1998年HpSA檢測(cè)被FDA批準(zhǔn)在臨床應(yīng)用后該方法就在世界各國(guó)被評(píng)價(jià)，平均敏感性和特異性可達(dá)到90-98％，HpSA檢測(cè)是一種廉價(jià)、實(shí)用的方法，不僅適用于治療前和治療后的診斷，而且對(duì)于各年齡段的兒童準(zhǔn)確性均很高。 Hp尿素酶B亞單位(ure

3、aseBunit,UreB)和Hp粘附素A亞單位(HelicobacterpyloriadhesinAunit,HpaA)均是位于Hp菌體表面的蛋白，在Hp各菌株中甚至球形體中都保守存在，其中UreB含量較高，占菌體總蛋白2.5-5％，而HpaA蛋白特異性較好，本研究擬通過(guò)制備抗Hp尿素酶B亞單位蛋白和鞭毛粘附素蛋白A蛋白的單克隆抗體，對(duì)抗體特性進(jìn)行鑒定，建立夾心ELISA檢測(cè)體系，對(duì)人糞便樣本進(jìn)行檢測(cè)，為Hp臨床診斷奠定基礎(chǔ)。

4、 方法： 1.抗UreB和抗HpaA單克隆抗體的制備采用雜交瘤技術(shù)制備抗UreB和HpaA單克隆抗體，對(duì)比硫酸銨沉淀法、辛酸-硫酸銨法、蛋白A柱親和層析法三種純化方法對(duì)單抗親和力的影響，從而確定最佳純化方案。 2.抗UreB和抗HpaA單克隆抗體特性的鑒定以非競(jìng)爭(zhēng)ELISA法測(cè)定單抗的親和常數(shù)；以ELISA相加實(shí)驗(yàn)初步確定單抗識(shí)別的表位；以間接熒光法分析單抗與Hp表面蛋白結(jié)合特性，以Westernblot鑒定單抗與重組蛋

5、白、Hp標(biāo)準(zhǔn)菌株、Hp臨床分離株、Hp球形體的反應(yīng)性，與腸致病性大腸桿菌、普通變形桿菌、綠膿桿菌、克雷白氏產(chǎn)氣桿菌等腸道常見(jiàn)菌的特異性。 3.夾心ELISA法的建立制備兔抗Hp多克隆抗體，建立(1)抗HpaA單抗包被、多抗夾心(2)抗UreB單抗包被、多抗夾心(3)抗UreB和HpaA單抗以10μg/ml，5μg/ml混合包被、多抗夾心等三種檢測(cè)系統(tǒng)，摸索了最適單抗包被量，最適夾心抗體量，最適封閉液及封閉時(shí)間，鑒定ELISA系統(tǒng)

6、對(duì)Hp標(biāo)準(zhǔn)菌株及四種腸道常見(jiàn)菌的反應(yīng)特異性，測(cè)定各ELISA系統(tǒng)的最低檢出限。 4.糞便樣本的檢測(cè)對(duì)經(jīng)13C確診的10份正常人糞便標(biāo)本和6份Hp陽(yáng)性患者糞便樣本進(jìn)行檢測(cè)，以陰性標(biāo)本的cut-off值為陽(yáng)性判斷標(biāo)準(zhǔn)。 結(jié)果： 1.制備了3株抗HpaA單抗，HpaA-2C6、HpaA-A2、HpaA-2B3；4株抗UreB單抗，UreB-6E6、UreB-1D6、UreB-1D5、UreB-9E1。對(duì)比三種抗體純化方

7、法的優(yōu)劣，結(jié)果表明，硫酸銨沉淀法、辛酸-硫酸銨法、蛋白A柱親和層析法UVP掃描抗體純度分別為80％、94％、97％，但硫酸銨沉淀法、辛酸-硫酸銨法純化得到的抗體相對(duì)親和力高于蛋白A柱親和層析法，因此選擇辛酸-硫酸銨法作為抗體純化方法。 2.間接免疫熒光法直接證明6E6和2C6能與Hp表面蛋白結(jié)合，westernblot證明7株單抗均與重組蛋白、Hp標(biāo)準(zhǔn)菌株、Hp臨床分離株、Hp球形體發(fā)生特異性反應(yīng)，與腸致病性大腸桿菌、普通變形桿

8、菌、綠膿桿菌、克雷白氏產(chǎn)氣桿菌無(wú)交叉反應(yīng)。7株單抗的親和常數(shù)在107-109之間，其中單抗HpaA-2C6和UreB-6E6親和常數(shù)為4.660×108，3.036×109，由于具有相對(duì)高的親和力做為ELISA檢測(cè)系統(tǒng)的候選抗體。 3.ELISA檢測(cè)系統(tǒng)的最適封閉液和封閉條件為10％FCS，37℃孵育2小時(shí)，而后4℃過(guò)夜。HpaA系統(tǒng)和UreB系統(tǒng)均能與Hp全菌發(fā)生特異性反應(yīng)，與其它四種腸道常見(jiàn)菌無(wú)特異性反應(yīng)。HpaA系統(tǒng)最低檢

9、出限為10.3μg/ml，UreB系統(tǒng)的最低檢出限為0.35μg/ml，HpaA和UreB單抗以5μg/ml、10μg/ml包被系統(tǒng)的最低檢出限為0.18μg/ml。 4.三種ELISA檢測(cè)系統(tǒng)中，UreB組的cut-off值為0.166，HpaA組的cut-off值為0.376，UreB和HpaA混合組的cut-off值為0.176。10例陰性樣本和6例陽(yáng)性樣本中，UreB組和混合組有無(wú)假陰性、假陽(yáng)性結(jié)果。而HpaA組出現(xiàn)三例

10、假陰性，無(wú)假陽(yáng)性結(jié)果。 結(jié)論： 1.通過(guò)雜交瘤技術(shù)成功制備了抗UreB和抗HpaA單抗，確定了純化單抗的最佳方案。 2.對(duì)7株單抗的特性進(jìn)行了鑒定，發(fā)現(xiàn)均具有較高的特異性，單抗HpaA-2C6和UreB-6E6由于具有較高親和常數(shù)而作為ELISA檢測(cè)系統(tǒng)的候選抗體。這些抗體在基因重組蛋白的純化、Hp致病機(jī)理的基礎(chǔ)性研究以及鼠源性抗體治療研究等方面可能具有重要的應(yīng)用價(jià)值。 3.初步建立了三種ELISA檢測(cè)系