轉染Smad7真核細胞表達質粒對大鼠肝纖維化的療效觀察.pdf

1、背景與目的：肝纖維化（hepatic fibrosis）是慢性肝病向肝硬化發(fā)展的必經環(huán)節(jié)。目前研究認為肝纖維化屬于可逆性病變，因此阻止和延緩肝纖維化的發(fā)生、發(fā)展則是治療肝硬化的關鍵。 肝纖維化是由于細胞外基質（extracelluar matrix，ECM）在肝內過多沉積的結果；肝星狀細胞（hepatic stellate cell，HSC）激活是肝纖維化過程的中心事件，激活的HSC可合成大量的ECM沉積在肝組織中，Ⅰ、Ⅲ型膠原

2、為其主要組成成分；轉化生長因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）是HSC活化并向肌成纖維細胞（myofibroblast，MFB）轉化的最重要的促進因子，其信號傳入依賴于其受體后信使分子SMAD蛋白來完成，即TGF-β/SMAD信號通路。Smad7是TGF-β/SMAD信號通路中的重要負性調節(jié)因子，通過抑制TGF-β的信號轉導發(fā)揮抗肝纖維化作用。目前有研究表明smad7可抑制Ⅰ型前膠原轉錄，但關于

3、Smad7對Ⅲ型前膠原表達的影響少有報道。 本研究利用分子克隆技術構建鼠Smad7真核表達重組質粒，采用四氯化碳復合法制備大鼠肝纖維化模型，以脂質體為載體將構建的鼠Smad7重組質粒介導轉染肝纖維化模型大鼠。運用western-blot定量檢測Smad7蛋白的表達，觀察外源Smad7基因能否有效轉染并表達；運用VG染色和HE染色法觀察組織病理學改變，了解外源Smad7基因對大鼠肝纖維化模型病理組織學改變的影響；運用免疫組化半定量

4、檢測Ⅲ型膠原纖維表達，觀察外源Smad7基因對大鼠肝纖維化模型Ⅲ型膠原纖維表達的影響。分析Smad7/pcDNA3.1（+）真核細胞表達質粒對實驗性大鼠肝纖維化發(fā)生、發(fā)展的影響。最終希望尋求一種防止和延緩各種慢性肝病肝纖維化和肝硬化發(fā)生、發(fā)展的有效方法并為肝纖維化的基因治療奠定理論基礎。 材料與方法：利用本課題組前期構建的smad7真核細胞表達質粒感受態(tài)細菌，使用上海生物工程公司UNIQ-500大劑量質粒試劑盒制備大劑量的Sma

5、d7/pcDNA3.1（+）真核細胞表達重組質粒。以脂質體Lipofectmine2000為載體將質粒介導轉染肝纖維化模型大鼠，通過瓊脂糖凝膠電泳觀察摸索Smad7/pcDNA3.1（+）重組質粒及pcDNA3.1（+）質粒與脂質體的配比關系。以經認證的同期出生、正常純種系雄性SD大鼠作為實驗對象。大鼠購回后適應性飼養(yǎng)2周開始實驗，實驗大鼠隨機分為4組：正常對照組（A組）、肝纖維化模型對照組（B組）、smad7質粒治療組（C組）、空質粒

6、組（D組）、每組20只。采用四氯化碳復合法制備大鼠肝纖維化模型。實驗進行兩周后，各組隨機取材一只大鼠，病理學診斷確定受攻擊組大鼠進入肝纖維化后，進行干預治療。smad7質粒治療組（C組）給予smad7/pcDNA3.1（+）重組質粒，每次100μg，每9天1次至第8周，共腹腔注射5次，空質粒組給予pcDNA3.1（+）空質粒治療，方法及劑量同C組。8周后取材大鼠做以下相關檢測，比較各組實驗大鼠的體重及肝重，Western-blot法檢測

7、各實驗組大鼠肝組織中smad7蛋白的表達，免疫組化檢測Ⅲ型膠原纖維的表達情況，并做半定量分析，應用HE，VG染色法觀察肝組織病理形態(tài)學變化，進行病理組織學診斷，使用SPSS11.5軟件分析描述實驗數(shù)據(jù)特征，計量資料做方差分析，等級資料作Ridit分析。 結果： 1.Ⅲ型膠原纖維的表達治療組與模型對照組和空質粒組比較，表達量下降，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。各組與正常組比較，表達量增加，差異有顯著性（P<0.01）。

8、 2.Smad7蛋白的表達治療組相比較于模型對照組和空質粒組，表達上調，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；各組表達量均顯著低于正常組，差異有顯著性（P<0.01）。 3.肝纖維化模型組和空質粒組比較，Ⅲ型膠原纖維及smad7蛋白的表達量無顯著性差異（P>0.05）。 結論： 1.成功利用四氯化碳復合法制備大鼠肝纖維化模型。 2.以脂質體Lipofectmine2000為載體將smad7/pcDN