大鼠彌漫性腦創(chuàng)傷中海馬區(qū)星形膠質細胞p-Cx43與神經元自噬的相互調控作用及分子機制研究.pdf

1、創(chuàng)傷性腦損傷(Traumatic brain injury, TBI)是青壯年人群的主要死因，也是現(xiàn)代社會最主要的住院原因之一。外力損傷神經元啟動一系列分子事件，導致腦組織水腫，神經元死亡，運動和認知功能受損。腦外傷后神經元自噬激活，加劇了腦損傷及神經功能缺失。神經元自噬參與了腦損傷的病理進程，但是關于神經元自噬的調控機制的研究甚少。目前國內外研究主要集中于神經元內的信號轉導通路，關于神經膠質細胞對神經元自噬的調控以及神經元自噬對神經膠

2、質細胞的影響未見報道。
　　近年來研究發(fā)現(xiàn)，TBI引起星形膠質細胞縫隙連接蛋白(connexin，Cx)表達明顯升高，進而影響其形成的縫隙連接允許細胞內小分子，離子及代謝物交換;TBI也引起星形膠質細胞P2X7受體激活，導致腦水腫及神經損傷;TBI所引起神經膠質細胞膜上的谷氨酸轉運體1蛋白（glial glutamatetransporter1，GLT-1）表達下調，導致細胞外興奮性氨基酸濃度升高，損傷神經元。但是關于星形膠質細胞

3、縫隙連接蛋白如何調控P2X7受體及谷氨酸轉運體，從而導致神經元自噬激活，影響突觸后電位的機制還未闡明。同時神經元自噬激活是否對星形膠質細胞的縫隙連接蛋白具有降解作用，從而自我調控，具有神經保護功能，目前不得而知。本論文分三部分闡述。
　　第一部分大鼠彌漫性腦創(chuàng)傷中海馬區(qū)星形膠質細胞p-Cx43對神經元自噬的調控
　　目的:本部分研究選用成年SPF級雄性SD大鼠應用改良Marmarou法制備閉合性彌漫性顱腦創(chuàng)傷大鼠模型，給予p

4、-Cx43特異性抑制劑甘珀酸(carbenoxolone，CBX)干預，檢測彌漫性腦創(chuàng)傷大鼠海馬區(qū)星形膠質細胞中p-Cx43對神經元自噬的影響。
　　方法:采用本實驗室改良Marmarou方法復制TBI大鼠模型。成年SPF級SD雄性大鼠192只數字隨機分組:①假手術組（Sham group）;②腦創(chuàng)傷組(TBI group);③腦創(chuàng)傷+溶劑組（Saline group）;④腦創(chuàng)傷+Carbenoxolone組(CBX group)

5、。取傷后3h、6h、24 h、48h4個時間點檢測下列指標:①HE染色觀察各組腦組織病理形態(tài)學改變;②免疫組織化學方法檢測海馬區(qū)p-Cx43和微管相關輕鏈-3(microtubule associatedproteinllight chain3，LC3)的蛋白定位表達;③Western-blot法檢測海馬區(qū)p-Cx43和LC3Ⅱ的蛋白表達;④免疫熒光雙標法檢測海馬區(qū)p-Cx43和LC3的蛋白共定位情況。應用Image Proplus6.

6、0，Image J和Image Lab4.1分析系統(tǒng)進行定量分析測定。實驗中數據均用(x)±s表示，用SPSS16.0統(tǒng)計軟件進行方差分析，兩兩比較采用Dunnett-t檢驗，以P＜0.05，表示差異有統(tǒng)計學意義。
　　結果:
　　1、光鏡下觀察大鼠腦創(chuàng)傷模型切片
　　1.1傷后大鼠腦組織大體觀察:傷后可見蛛網膜下腔出血以及少量腦室出血;腦實質多見點狀出血，以腦干的背側多見，腦組織表面血管充血明顯，并可見腦組織腫脹及局

7、部腦挫傷。
　　1.2 HE染色觀察組織形態(tài)學的改變:Sham組大鼠海馬區(qū)細胞形態(tài)結構正常，排列整齊，神經元數量多且形態(tài)正常;TBI24 h組和Saline溶劑組神經元胞體腫脹明顯，胞漿染色淺淡，核皺縮濃染，細胞與細胞之間出現(xiàn)間隙，神經元出現(xiàn)變性及壞死改變。CBX治療組較TBI組和Saline溶劑組相比，神經元胞體腫脹緩解，及核濃縮明顯減輕，神經元周圍間隙明顯較小。
　　2、海馬區(qū)p-Cx43和LC3免疫組化檢測結果

8、　　p-Cx43定位于海馬區(qū)星形膠質細胞的胞質和胞膜中，Sham組偶見陽性細胞，著色淺淡。TBI24 h組和Saline溶劑組與Sham組比較，傷后p-Cx43陽性細胞顯著增多，著棕色加深，免疫反應性增強(P＜0.05)。CBX治療組p-Cx43免疫反應性明顯減弱(P＜0.05);LC3定位于海馬區(qū)神經元的胞質，Sham組可見少量陽性細胞，且胞漿著色淺淡。TBI24 h組和Saline溶劑組與Sham組比較，LC3陽性細胞數明顯增多，胞

9、漿呈現(xiàn)深棕色，免疫反應性明顯增強(P＜0.05)。與TBI組和Saline溶劑組相比，CBX治療組LC3免疫反應性明顯減弱(P＜0.05)。
　　3、海馬區(qū)p-Cx43和LC3的Westem blot檢測結果
　　Sham組p-Cx43蛋白表達量在各時間點無變化;TBI組和Saline溶劑組p-Cx43蛋白表達量隨著傷后時間的推移，逐漸增高，與Sham組比較，傷后3h開始顯著升高(P＜0.05)，6h達高峰，高表達狀態(tài)持續(xù)至

10、傷后24 h(P＜0.05)。CBX治療組各時間點蛋白表達趨勢與TBI和Saline組相似，但表達量明顯降低(P＜0.05)。Cx43總蛋白表達量在腦創(chuàng)傷后各時間點無變化。Sham組LC3Ⅱ的有微量的蛋白表達，且各時間點無差異;與Sham組相應時間點比較，TBI組和Saline溶劑組LC3Ⅱ的蛋白表達量顯著升高(P＜0.05)，且呈現(xiàn)一定的動態(tài)變化趨勢，于損傷6h開始升高，24h達高峰，持續(xù)至傷后48h。CBX治療組各時間點蛋白表達趨勢

11、與TBI和Saline組相似，但LC3ⅡI表達量明顯降低(P＜0.05)。
　　4、TBI后海馬區(qū)LC3與神經元特異性標記物(neuronal nuclei，NeuN)以及p-Cx43與星形膠質細胞特異性標記物（glial fibrillary acidic protein，GFAP）熒光雙標檢測結果
　　激光共聚焦顯微鏡下可見LC3為DyLight488標記的細胞胞漿綠色熒光，NeuN為DyLight594標記的細胞核周紅

12、色熒光。可見海馬區(qū)綠色熒光與紅色熒光大部分重疊，呈現(xiàn)橙色聚集，并基本完全重合，說明自噬主要發(fā)生在神經元。激光共聚焦顯微鏡下P-Cx43為DyLight488標記的細胞胞漿綠色熒光，GFAP為DyLight594標記的星形膠質細胞紅色熒光，在海馬區(qū)重疊呈橙色聚集，說明P-Cx43定位于星形膠質細胞。
　　小結:改良的Marmarou彌漫性腦創(chuàng)傷模型滿足了本實驗對P-Cx43和LC3的研究;大鼠腦創(chuàng)傷后，P-Cx43和LC3蛋白表達持

13、續(xù)升高，并且免疫反應性增強，P-Cx43定位于海馬區(qū)星形膠質細胞，LC3定位于海馬區(qū)神經元細胞，給予縫隙連接阻斷劑CBX同時抑制P-Cx43和LC3蛋白表達及免疫反應性，改善了腦損傷后神經元腫脹及核濃縮，具有一定的神經保護作用。
　　第二部分大鼠彌漫性腦創(chuàng)傷中海馬區(qū)星形膠質細胞p-Cx43通過激活P2RX7和下調GLT-1表達對神經元自噬調控的分子機制研究
　　目的:p-Cx43如何通過P2RX7和谷氨酸轉運體GLT-1調控

14、神經元自噬，以及對海馬興奮性突觸后電位和空間學習記憶的影響。
　　方法:大鼠模型同上，將156只成年SPF級雄性SD大鼠隨機分成6組:①假手術組(n=36)，②腦創(chuàng)傷組(n=66)③腦創(chuàng)傷24 h+Saline溶劑組(n=24)(④腦創(chuàng)傷24 h+CBX抑制劑組(n=6)⑤腦創(chuàng)傷24h+OxATP抑制劑組(n=12)⑥腦創(chuàng)傷24h+Ceftriaxone組(n=12)。術后時間點同上。檢測①免疫組織化學法檢測海馬區(qū)P2X7、GLT

15、-1的蛋白表達、定位;②激光共聚焦法檢測p-Cx43、P2X7、GLT-1的蛋白共定位情況;③Western-blot法檢測P2X7、GLT-1和LC3的蛋白表達量。另取30只大鼠隨機分為假手術組、腦創(chuàng)傷24 h組，腦創(chuàng)傷24 h+Saline溶劑組，腦創(chuàng)傷24 h+CBX抑制劑組，腦創(chuàng)傷24 h+3-MA(3-methyladenine)抑制劑組，記錄海馬腦片興奮性突觸后電位，Clampfit10.0檢測其長時程增強(LTP,long

16、-term potentiation)的變化。再取30只大鼠行水迷宮測試，隨機分為假手術組、腦創(chuàng)傷14d組，腦創(chuàng)傷14 d+Saline溶劑組，腦創(chuàng)傷14 d+CBX抑制劑組，腦創(chuàng)傷14 d+3-MA抑制劑組，檢測其空間學習記憶能力，使用Smart軟件記錄分析潛伏期。定量分析和統(tǒng)計同上。
　　結果:
　　1、Morris水迷宮結果
　　使用Morris水迷宮檢測大鼠空間學習記憶能力。TBI組和Saline溶劑組傷后第1

17、4 d較Sham組相比大鼠搜索安全島潛伏期明顯延長(P＜0.05)。CBX抑制劑組和3-MA抑制劑組傷后第14 d搜索安全島運動軌跡均較TBI組和Saline溶劑組明顯改善，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　2、長時程增強(LTP)結果
　　使用長時程增強檢測長時記憶有重要意義。TBI24 h組和Saline溶劑組傷后興奮性突觸后電位幅度、斜率較Sham組均明顯降低、減小，組間差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。CBX抑

18、制劑組和3-MA抑制劑組傷后突觸后電位幅度、斜率均較TBI24 h組和 Saline溶劑組明顯增高、加大,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　3、海馬區(qū)P2X7受體和GLT-1免疫組化檢測結果
　　P2X7受體定位于海馬區(qū)星形膠質細胞的細胞膜上，Sham組可見陽性細胞，著棕色。TBI24 h組和Saline溶劑組與Sham組比較，傷后P2X7受體陽性細胞無顯著增多(P＞0.05)。OxATP治療組P2X7受體免疫反應性無

19、明顯改變(P＞0.05);GLT-1定位于海馬區(qū)星形膠質細胞細胞膜，Sham組可見陽性細胞，著棕色。TBI24 h組和Saline溶劑組與Sham組比較，傷后GLT-1陽性細胞數顯著減少，胞膜呈現(xiàn)淺棕色，免疫反應性減弱(P＜0.05)。Cef治療組GLT-1免疫反應性明顯增強(P＜0.05)。
　　4、腦創(chuàng)傷后24 h海馬區(qū)P-Cx43、P2X7、GLT-1與GFAP的激光共聚焦檢測結果
　　海馬區(qū)p-Cx43為DyLigh

20、t647標記的陽性細胞胞漿紫色熒光，P2X7為DyLight488標記的陽性細胞胞膜為綠色熒光，星形膠質細胞標記物GFAP為DyLight594標記的紅色熒光，三色Merge呈黃色，說明p-Cx43、P2X7共定位于星形膠質細胞;海馬區(qū)GLT-1為DyLight647標記陽性細胞胞膜為紫色熒光，P2X7為DyLight488標記陽性細胞胞膜為綠色熒光，星形膠質細胞標記物GFAP為DyLight594標記紅色熒光，三色Merge呈黃色，說

21、明GLT-1、P2X7也共定位于星形膠質細胞。
　　5、Western blot檢測結果
　　TBI24 h組和Saline溶劑組與Sham組相比LC3Ⅱ的蛋白表達量升高，組間差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);TBI24 h+CBX抑制劑組、OxATP抑制劑組、Ceftriaxone組LC3Ⅱ的蛋白表達與TBI24 h組和Saline溶劑組相比表達量下降，組間差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。TBI組與Sham組比較，傷后6

22、 h GLT-1蛋白量顯著降低(P＜0.05)，傷后24 h達高峰;TBI24 h組和Saline溶劑組與Sham組相比GLT-1的蛋白表達量降低，組間差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05); TBI24 h+CBX抑制劑組、OxATP抑制劑組GLT-1的蛋白表達與TBI24 h組和Saline溶劑組相比表達量升高，組間差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。TBI組與Sham組比較，傷后P2X7蛋白量無顯著變化(P＞0.05); TBI24 h組

23、和Saline溶劑組與Sham組相比P2X7的蛋白表達量無組間差異(P＞0.05); TBI24 h+CBX抑制劑組P2X7的蛋白表達與TBI24h組和 Saline溶劑組相比組間無差異(P＞0.05)。
　　小結:大鼠彌漫性腦創(chuàng)傷后海馬區(qū)星形膠質細胞p-Cx43通過激活P2X7受體，下調GLT-1蛋白表達，調控神經元自噬，從而影響海馬區(qū)長時程記憶及空間學習記憶能力。
　　第三部分大鼠彌漫性腦創(chuàng)傷中海馬區(qū)神經元自噬對星形膠質

24、p-Cx43降解作用
　　目的:通過大鼠彌漫性腦創(chuàng)傷中海馬區(qū)神經元自噬對星形膠質細胞p-Cx43降解機制的研究，闡明不但海馬區(qū)星形膠質細胞對神經元具有調控作用，同時神經元也對星形膠質細胞具有一定調節(jié)作用。
　　方法:將120只成年雄性SD大鼠隨機分成4組:①假手術組(n=30)，②腦創(chuàng)傷組(n=36)③腦創(chuàng)傷+Saline溶劑組(n=24)④腦創(chuàng)傷+3-MA抑制劑組(n=30)。每組又分別劃分為傷后3h、6h、24h、48h

25、4個時間點。檢測①免疫熒光雙標法檢測GFAP、LC3和p-Cx43的蛋白表達定位情況;②Western-blot法檢測LC3和P-Cx43的蛋白表達量;③透射電鏡檢測神經元自噬體對縫隙連接的吞噬。分析和統(tǒng)計同前。
　　結果:
　　1、海馬區(qū)LC3和p-Cx43的Western blot檢測結果
　　Sham組LC3Ⅱ/β-actin的比值在各時間點無變化;與Sham組比較，傷后6h開始TBI組LC3Ⅱ/β-actin的

26、比值逐漸升高，24 h達峰值，48 h仍高表達，組間差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05); TBI組與Saline溶劑組比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05);3-MA抑制劑組LC3Ⅱ/β-actin比值變化趨勢與TBI組相似，但比值明顯變小，傷后6h、24 h和48h差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。p-Cx43的表達在TBI組各個時間點與Sham組比較，傷后3h開始升高，持續(xù)到傷后24 h，組間蛋白量表達有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);

27、TBI組與Saline溶劑組比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05);3-MA抑制劑組p-Cx43明顯變大，與TBI組和Saline溶劑組比較傷后6h和24 h差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　2、腦創(chuàng)傷后海馬區(qū)GFAP、LC3和p-Cx43的激光共聚焦檢測結果
　　海馬區(qū)星形膠質細胞標記物GFAP為DyLight488標記的綠色熒光，LC3為DyLight673標記的陽性細胞胞漿紫色熒光，p-Cx43為DyLight5

28、94標記的陽性細胞胞漿紅色熒光，用DAPI行海馬區(qū)細胞藍色核染色。在sham組LC3紫色和P-Cx43紅色數量少;TBI組LC3紫色和p-Cx43紅色陽性強度都增加明顯;3-MA抑制劑組LC3紫色陽性強度較TBI組明顯減少，但p-Cx43紅色陽性強度較TBI組又明顯增加。LC3紫色主要定位于海馬區(qū)神經元;P-Cx43紅色與GFAP綠色Merge成橙色分布于海馬區(qū)星形膠質細胞。
　　3、透射電鏡的檢測結果
　　我們使用透射電鏡

29、對腦創(chuàng)傷24 h后大鼠海馬區(qū)神經元與星形膠質細胞縫隙連接超微結構進行觀察顯示:神經元細胞漿內靠近縫隙連接處可見自噬溶酶體結構。
　　小結:大鼠彌漫性腦創(chuàng)傷后，抑制海馬區(qū)神經元自噬導致星形膠質細胞p-Cx43表達升高;透射電鏡可見海馬區(qū)神經元與星形膠質細胞縫隙連接旁自噬溶酶體的存在。揭示大鼠彌漫性腦創(chuàng)傷后海馬區(qū)神經元自噬對星形膠質細胞p-Cx43的表達具有降解作用。
　　結論:
　　大鼠彌漫性腦創(chuàng)傷中海馬區(qū)星形膠質細胞P