抑制Beclin1促進TOCP誘導(dǎo)人成神經(jīng)瘤SH-SY5Y細胞產(chǎn)生凋亡.pdf

1、目的
　　探討自噬與凋亡在三鄰甲苯基磷酸酯（Tri-ortho-cresyl phosphate，TOCP）誘發(fā)SH-SY5Y細胞神經(jīng)毒性中的關(guān)系，進一步闡述TOCP神經(jīng)毒性的作用機制。
　　方法
　　1．采用RNAi技術(shù)，構(gòu)建pGenesil-1-Beclin1-shRNA真核表達載體；將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染SH-SY5Y細胞，G418篩選出Beclin1穩(wěn)定低表達的SH-SY5Y細胞系（sh-Beclin1細胞系），RT-

2、PCR與Western blot檢測sh-Beclin1細胞系Beclin1基因的mRNA與蛋白表達。
　　2．不同濃度TOCP（0，0.5mM）分別處理SH-SY5Y細胞與sh-Beclin1細胞48h，MDC染色觀察兩組細胞系自噬泡的數(shù)量變化，Western blot檢測兩組細胞中LC3-II蛋白的表達。
　　3．不同濃度 TOCP（0，0.25，0.5，1.0mM）分別處理 SH-SY5Y細胞與sh-Beclin1細胞

3、48h，Hoechst33258染色觀察兩組細胞系細胞核形態(tài)，流式細胞儀檢測兩組細胞系細胞周期的變化,Western blot檢測兩組細胞系凋亡相關(guān)基因Bax，Bcl-2，Caspase-3蛋白的表達。
　　結(jié)果
　　1．測序證實pGenesil-1-Beclin1-shRNA真核表達載體構(gòu)建成功。熒光顯微鏡觀察、RT-PCR和Western blot技術(shù)鑒定Beclin1基因穩(wěn)定敲減SH-SY5Y細胞系建立成功。
　

4、　2．MDC染色結(jié)果和Western blot結(jié)果顯示，與對照組SH-SY5Y細胞比較， TOCP(0.5mmol/L)處理sh-Beclin1細胞系48h后，產(chǎn)生自噬泡的數(shù)量明顯減少， LC3-II蛋白表達明顯降低。
　　3．與對照組SH-SY5Y細胞比較，sh-Beclin1細胞經(jīng)不同濃度TOCP（0，1.0mM）處理48h后進行Hoechst33258染色，在熒光顯微鏡下可見細胞核藍色熒光增強，染色質(zhì)聚集明顯，且有部分細胞出

5、現(xiàn)細胞核碎裂、溶解，細胞出現(xiàn)典型的凋亡現(xiàn)象，且產(chǎn)生核碎裂的細胞數(shù)量隨TOCP濃度升高而增加。
　　4．不同濃度的TOCP（0，0.25，0.5，1.0mM）處理SH-SY5Y細胞和sh-Beclin1細胞48h后，流式細胞儀檢測細胞周期結(jié)果顯示：與對照組SH-SY5Y細胞比較，sh-Beclin1細胞 G1期前有亞二倍體凋亡峰的出現(xiàn)，并凋亡細胞數(shù)量隨著TOCP濃度增高而增多，并呈現(xiàn)劑量-效應(yīng)關(guān)系（P<0.05）。
　　5．不

6、同濃度的TOCP（0，0.25，0.5，1.0mM）處理SH-SY5Y細胞和sh-Beclin1細胞48h后，Western blot檢測凋亡相關(guān)蛋白結(jié)果顯示：在SH-SY5Y細胞中，凋亡相關(guān)蛋白bcl-2/bax比值無升高或降低趨勢，Cleaved-caspase-3蛋白表達無顯著變化，在sh-Beclin1細胞中，凋亡相關(guān)蛋白bcl-2/bax比值呈降低，并呈劑量-效應(yīng)關(guān)系（P<0.05），cleaved-caspase-3蛋白表達