阿魏酸鈉洗脫支架的制備及生物學性能研究.pdf

1、研究背景和目的:
　　缺血性腦血管疾病是高度致殘致死性疾病,占腦血管疾病的75％-85%,30%-60%的缺血性腦血管病的發(fā)生可歸因于頸動脈的狹窄,外科干預治療頸動脈狹窄的主要措施包括頸動脈球囊擴張成形術,頸動脈支架植入術,頸動脈內膜剝脫術和搭橋手術。然而這些干預措施之后,再狹窄也隨之發(fā)生,血管管腔直徑逐漸減少,缺血癥狀再次出現(xiàn),甚至導致血管閉塞。因此術后再狹窄的發(fā)生嚴重影響了手術的遠期收益和療效[1],再狹窄的發(fā)生相當普遍,腦血

2、管,冠脈血管,腎動脈,及其他外周血管術后均會出現(xiàn)不同程度的狹窄。新生內膜過度增生是球囊成形術后和支架植入術后再狹窄的主要病理特征[2]。新生內膜增殖是指血管平滑肌大量增殖并進入血管內膜或中層結構,它是血管內膜層受損后普遍存在的反應。新生內膜形成與許多因素有關。內皮損傷是其中一個關鍵因素[3],光滑完整的內皮層能降低血栓和動脈粥樣硬化的發(fā)生[4],內皮細胞和平滑肌細胞密切相關,它調節(jié)著血管的收縮節(jié)律,并且通過一氧化氮、內皮素和前列腺素等途

3、徑調節(jié)著平滑肌的增殖。平滑肌細胞發(fā)生表型轉換,分化型平滑肌細胞轉變成分化程度較低的分泌型細胞(未分化或去分化型),其增殖和遷移能力增強,這是新生內膜形成的關鍵步驟之一[3]。
　　血管成形術是一種機械擴張狹窄或阻塞血管,使血管通暢的手術技術,病變血管狹窄和閉塞往往是由動脈粥樣硬化而導致。血管成形術是一種微創(chuàng)手術,它通過球囊導管到達血管狹窄部位,充盈球囊壓迫粥樣硬化斑塊,使斑塊壓縮至血管壁,然后回撤塌陷球囊,開放血管恢復血流。支架可

4、以在球囊擴張的時候一并放入以維持血管開放狀態(tài)。為降低再狹窄發(fā)生率,血管支架在不斷改進,生物學性能也更加優(yōu)秀。支架由最初的裸金屬支架,演化出涂層支架,藥物洗脫支架和可降解支架等。藥物洗脫支架已成為心血管介入手術中應用較為廣泛的植入器械。紫杉醇、雷帕霉素及其類似物被用于藥物洗脫支架,有效抑制了平滑肌增殖,但是這些不可控、非特異的影響細胞周期的藥物也明顯抑制了血管內皮細胞的生長,阻止內皮重新愈合,導致晚期血栓形成和晚期支架內再狹窄[5-11]

5、。許多其他藥物也被試驗性的用于涂層支架,其目的是減少再狹窄和血栓的發(fā)生,可是效果并不理想。例如,皮質類固醇激素地塞米被用于治療炎癥、免疫疾病,還能抑制平滑肌細胞增殖[12],但是臨床研究顯示地塞米松洗脫支架并不能有效抑制再狹窄。BENESTENT II試驗對肝素涂層支架的抗再狹窄作用進行了評估,結果表明肝素涂層支架的促凝性明顯降低,但是并沒抑制新生內膜增生,對再狹窄沒有改善[13]。由于支架植入術后病人需長期口服抗血小板藥物,肝素涂層支

6、架實際作用受到質疑。磷酸膽堿是細胞膜的主要成分,具有良好的血液相容性和組織相容性。將磷酸膽堿涂層支架植入實驗動物(兔和豬)體內發(fā)現(xiàn)既沒有促進新生內膜增生,也沒有抑制再狹窄[14]。理想的藥物涂層應能抑制平滑肌增生,同時促進內皮生長、愈合;完整光滑功能良好的內皮也是防止血栓形成的重要條件。因此,重視內皮功能恢復就有可能降低再狹窄率發(fā)生[15-17],新的有效藥物成為研究的熱點,同時也是臨床治療的關鍵。
　　阿魏酸是一種源于植物的酚酸

7、,它及其鈉鹽形式阿魏酸鈉(sodium ferulate,SF)有多重生物學作用,包括抗腫瘤[18],抗動脈粥樣硬化[19,20],抗血小板[21,22],抗氧化,抗炎[23,24]。然而目前阿魏酸鈉對內皮細胞作用的研究較少,其作用機制仍不清楚。本研究利用細胞培養(yǎng)和分子生物學技術觀察、探討了SF對臍靜脈內皮細胞增殖和遷移的影響,為SF抗再狹窄作用的臨床應用提供理論基礎;然后將阿魏酸鈉和4種多聚物載體相結合,用浸涂法制作阿魏酸鈉多聚物涂層

8、支架,在顯微鏡及電鏡下觀察自制涂層支架表面形態(tài)學,利用高效液相色譜技術測量藥物緩釋動力學,體外實驗檢測血液相容性,為動物體內實驗打下基礎。
　　方法:
　　培養(yǎng)人臍靜脈內皮細胞,用不同濃度阿魏酸鈉處理細胞,分為6組,對照組0μg/ml,0.1μg/ml,1μg/ml,10μg/ml,100μg/ml和1000μg/ml,在兩個時間點,即處理24小時和48小時,用CCK-8試劑盒檢測細胞活性。同樣,采用劃痕愈合試驗觀察不同藥物

9、濃度對細胞遷移能力的影響。采用免疫細胞化學和Western blot觀察細胞內叉頭蛋白M1(FoxM1)和血管內皮生長因子(VEGF)的表達。
　　另一方面,用浸涂法制作阿魏酸鈉多聚物涂層支架,顯微鏡和掃面電鏡下觀察阿魏酸鈉多聚物涂層支架的表面形態(tài);高效液相色譜測量自制涂層支架阿魏酸鈉的釋放量;通過溶血率、凝血酶原時間和活化部分凝血活酶時間實驗,檢測自制涂層支架血液相容性。
　　結果:
　　1.阿魏酸鈉處理HUVECs

10、24小時后,在10μg/ml和100μg/ml處理組,細胞活性與對照組相比明顯提高;48小時后,細胞增殖趨勢更加明顯,在0.1-100μg/ml組細胞活性與對照組相比明顯提高,然而在1000μg/ml處理組,細胞活性降低明顯(P<0.05)。
　　2.處理12小時,在1-100μg/ml組中,細胞遷移能力與對照組相比增強;處理24小時后,在0.1-100μg/ml組中,細胞遷移能力與對照組相比明顯增強;處理48小時后,在0.1-1

11、00μg/ml組,細胞遷移能力與對照組相比增強,然而在1000μg/ml處理組中,細胞遷移能力明顯受抑制(P<0.05)。
　　3.藥物處理12小時后,在1-100μg/ml組,細胞內FoxM1紅色熒光的強度與對照相比明顯增強,在0.1-100μg/ml組,HUVECs內 VEGF紅色熒光強度增強(P<0.05)。
　　4.Western blot分析FoxM1和VEGF表達量的變化,研究發(fā)現(xiàn),藥物處理12和24小時后,在0

12、.1-100μg/ml處理組,FoxM1的表達均較對照組顯著提高;藥物處理12小時,在10-100μg/ml處理組,VEGF中表達較對照組明顯增強,處理24小時后,與對照組相比,VEGF的表達在0.1-100μg/ml處理組中均增強(P<0.05)。
　　5.四種多聚物涂層支架(PLGA50,PLGA75,PDLLA和PLLA),涂層表面形態(tài)均一完整,較少出現(xiàn)多聚物聚集、橋接、開裂、剝脫等現(xiàn)象。4種涂層無明差異。
　　6.P

13、LGA50和PLGA75支架組與PDLLA和PLLA相比,釋放更為持續(xù)、良好。PLGA50和PLGA75釋放量高于PDLLA和PLLA組。
　　7.裸支架組和4種多聚物涂層支架組(PLGA50,PLGA75,PDLLA和PLLA),溶血率均<5%。四種多聚物涂層支架組PT和APTT與商品化金屬裸支架組無明顯差異。
　　結論:
　　阿魏酸鈉促進內皮細胞的增殖和遷移,上調了FoxM1和VEGF的表達,呈劑量依賴性。阿魏酸鈉