新型載體材料PEI-PCL-PEG用于基因遞送的研究.pdf

1、作為基因治療一個關鍵環(huán)節(jié)，轉基因載體仍是研究的一個瓶頸。由于病毒載體的安全性隱患，用化學方法構建非病毒基因輸送體系成為理想的選擇。其主要優(yōu)勢有：無免疫原性、不受輸送基因分子量大小的限制和易于分子構建以獲得合適的功能，然而相對較低的轉染效率和由載體所帶正電荷導致的化學毒性限制了非病毒載體的進一步應用。本論文旨在構建一種新型的可降解的基因傳遞系統(tǒng)，以達到高效低毒的目的，同時能對今后的非病毒載體構建和應用起到借鑒作用。
　　（1）可生物

2、降解的基因載體PEG-PCL-PEI的合成與表征：首先以辛酸亞錫作為催化劑，聚乙二醇單甲醚（MPEG）為引發(fā)劑，通過開環(huán)聚合反應制備二嵌段共聚物（MPEG-b-PCLs），然后將二嵌段共聚物的羥基末端依次活化成為羧基和琥珀酰亞胺端基，形成MPEG-b-PCLs-COOH活化物和MPEG-b-PCLs-NHS活化物；然后將親水性的MPEG-b-PCLs-NHS活化物接枝到聚乙烯亞胺(PEI)的氨基側鏈上，得到PEI的接枝產物—一種新穎的可

3、生物降解的兩性聚合物（PEI-g-PCL-b-PEG），應用FTIR，1H-NMR等分析手段對中間產物和最終產物進行表征，GPC檢測聚合物的分子量以及分子量分布。根據(jù)檢測結果推算出聚合物的平均分子量及接枝率，最終產物為：PEI10K-g-（PCL1.2K-b-MPEG5K）1.4。
　?。?）聚合物/pDNA復合物體外轉染實驗研究：用合成的載體材料PEI10K-g-（PCL1.2K-b-MPEG5K）1.4進行了體外質粒DNA（p

4、DNA）轉染實驗，初步地考察了聚合物/pDNA質量比、轉染時間、培養(yǎng)基pH對轉染效率的影響，結果證明，聚合物載體PEI10K-g-（PCL1.2K-b-MPEG5K）1.4能夠成功地將質粒報告基因pEGFP轉入細胞核內，并且轉染效率隨著時間的延長而提高；用pH=6.8的培養(yǎng)基進行轉染，效果優(yōu)于正常培養(yǎng)基；在聚合物/pDNA質量比為10的時候轉染效果較好。
　?。?）PEI-PCL-PEG用于siRNA遞送的研究：用PEI10K-g

5、-（PCL1.2K-b-MPEG5K）1.4/siRNA復合物進行體外轉染實驗，考察了各N/P比復合物對螢火蟲熒光素酶基因表達的沉默效率；研究了復合物的粒徑、Zeta電位與N/P比（PEI中所含“氮”的納摩爾：DNA中“磷”的納摩爾）的關系；比較了PEI10K-g-（PCL1.2K-b-MPEG5K）1.4與PEI10K單體兩者遞送siRNA的效果以及兩種載體的細胞毒性。結果顯示，在N/P=125時對細胞的基因沉默效果較好，與陽性對照組

6、比較無顯著差異（P＞0.01）；PEI10K-g-（PCL1.2K-b-MPEG5K）1.4/siRNA復合物的粒徑隨著N/P比的增加而減小，Zeta電位隨著N/P比的增加而升高；轉染4T1Luc細胞的結果顯示，載體PEI10K-g-（PCL1.2K-b-MPEG5K）1.4遞送siRNA的能力強于PEI10K，兩者具有顯著性差異（P﹤0.01），MTT實驗數(shù)據(jù)顯示，無論是在相同N/P還是相同濃度時載體PEI10K-g-（PCL1.2K