熒光定量PCR檢測(cè)豬肉中單核細(xì)胞增生性李斯特氏菌的研究.pdf

1、單核細(xì)胞增生性李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）簡(jiǎn)稱(chēng)單增李斯特，它是一種能夠引起人畜共患的食源性致病菌，屬李斯特菌屬。它在自然界中分布廣泛，如土壤、腐敗的蔬菜及多種食品中。食用了被單增李斯特污染的食物后可以引起“李氏桿菌病”，使人和動(dòng)物患腦膜炎、敗血癥、流產(chǎn)等，死亡率可達(dá)20％～30％。傳統(tǒng)的檢測(cè)單增李斯特的方法操作繁瑣、檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng)，通常需要5～7 d 才能完成且靈敏度較低。因此需要建立快速、靈敏的單增李斯特的

2、檢驗(yàn)方法。熒光定量 PCR 技術(shù)已經(jīng)成為針對(duì)食源性致病菌的一種常規(guī)的分子檢測(cè)方法，廣泛應(yīng)用于食品檢測(cè)中，靈敏度好檢出率高，由于該技術(shù)不僅實(shí)現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍，而且與常規(guī)PCR相比，它具有特異性更強(qiáng)、自動(dòng)化程度高等特點(diǎn)，目前已得到廣泛應(yīng)用。
　　 本試驗(yàn)利用熒光定量與鎖定寡核苷酸相結(jié)合的方法快速檢測(cè)單核增生性李斯特氏菌。試驗(yàn)中我們選取hlyA基因作為靶基因，但針對(duì)這個(gè)基因我們發(fā)現(xiàn)其片段的GC含量非常低，通常在40％以下，

3、這就造成不能設(shè)計(jì)出合適的引物和探針，從而造成信號(hào)收集效果差，試驗(yàn)靈敏度低，影響檢出率。為了克服這個(gè)問(wèn)題，我們采取熒光定量PCR檢測(cè)手段和鎖定寡核苷酸（LNA）相結(jié)合的方法進(jìn)行檢測(cè)。鎖定核苷酸是雙核酸結(jié)構(gòu)，在試驗(yàn)中可以增強(qiáng)寡核苷酸的親和力和檢測(cè)的特異性，并且加強(qiáng)寡核苷酸鏈的穩(wěn)定性和堿基堆積力，從而提高試驗(yàn)的準(zhǔn)確性和靈敏度。
　　 本研究利用專(zhuān)業(yè)軟件設(shè)計(jì)出合適的特異性引物和探針，經(jīng)過(guò)普通PCR擴(kuò)增后，獲得119 bp產(chǎn)物并將PCR產(chǎn)

4、物進(jìn)行2 ％的瓊脂糖凝膠電泳，產(chǎn)物膠回收純化后連接到pUC119載體上，并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞中，對(duì)陽(yáng)性克隆進(jìn)行了篩選鑒定，構(gòu)建了目的重組質(zhì)粒，作為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。并對(duì)插入的外源基因進(jìn)行了測(cè)序，與文獻(xiàn)報(bào)道的序列相似性達(dá)到100％，從而證實(shí)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物確為目的擴(kuò)增產(chǎn)物。構(gòu)建的重組質(zhì)?？梢缘玫捷^好的擴(kuò)增曲線和Ct值。試驗(yàn)中對(duì)比三種從豬肉中提取單增李斯特的方法，確定優(yōu)選，還利用普通PCR確定引物特異性良好。
　　

5、對(duì)PCR反應(yīng)體系中退火溫度、引物探針配比等進(jìn)行了優(yōu)化，以確定適宜PCR反應(yīng)體系和PCR擴(kuò)增程序。適宜反應(yīng)體系為：12.5 μL PremiXEXTaq(2×)，上、下游引物(各10 μM)各0.5 μL，1μL目的探針（3 μM）,2 μL模板,8.5 μL滅菌雙蒸水，總反應(yīng)體系25 μL；適宜擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性10 S，再按94℃ 5 S－60℃30 S進(jìn)行45個(gè)循環(huán)。
　　 本方法純菌培養(yǎng)物檢測(cè)靈敏度可以達(dá)到30 co