流體剪切力作用下破骨細胞的鈣響應特征及機制.pdf

1、目的：骨組織是結構可動態(tài)變化的器官，力學因素在維持其正常代謝活動中發(fā)揮重要作用。骨組織內(nèi)部的多孔間隙內(nèi)充滿間質(zhì)液，血管壓力和機械負荷作用下會使間質(zhì)液產(chǎn)生流體運動，進而在骨內(nèi)膜表面產(chǎn)生不同程度的流體剪切力，骨表面的成骨細胞和破骨細胞以及骨基質(zhì)內(nèi)的骨細胞在流體剪切力作用下其生物學性質(zhì)都會發(fā)生明顯變化。
　　 人體正常的骨代謝主要包括成骨細胞分泌骨基質(zhì)和破骨細胞吸收陳舊骨基質(zhì)，其中破骨細胞是目前已知唯一具有骨基質(zhì)吸收功能的細胞。許多研

2、究表明破骨細胞的形成及其破骨功能和鈣離子信號密切相關。鈣信號涉及到細胞內(nèi)信號傳導、細胞遷移、分化及骨基質(zhì)吸收等諸多生物學過程，但目前關于力學因素對破骨細胞的胞內(nèi)鈣離子濃度振蕩及細胞功能的影響的研究仍較為缺乏，而這一過程可能對破骨細胞的形成和分化具有重要的生理意義。因此本研究主要關注以下兩個問題：在體外培養(yǎng)條件下，流體剪切力能否誘發(fā)破骨細胞發(fā)生鈣響應？如果有鈣響應的發(fā)生，那么是否會對破骨細胞功能產(chǎn)生影響？解決這兩個問題可為臨床上調(diào)控力學因

3、素對進而影響骨代謝提供科學依據(jù)和合理指導。
　　 方法：1、破骨細胞的培養(yǎng)。本研究中采用了三種破骨細胞培養(yǎng)方法，包括使用M-CSF(Macrophagecolony-stimulatingfactor)和RANKL(ReceptorActivatorofNuclearFactor-BLigand)誘導原代造血干細胞形成破骨細胞、使用M-CSF和RANKL促進RAW264.7細胞形成破骨細胞、使用MC3T3-E1細胞上清誘導RAW

4、264.7細胞形成破骨細胞。在不同誘導時間（0天、4天和8天）對破骨細胞的相關特性，例如如凋亡、細胞核數(shù)目與面積關系等，進行了分析探討。
　　 2、流體剪切力誘發(fā)破骨細胞的鈣響應特征及分析。使用Fluo-4AM對破骨細胞內(nèi)鈣離子進行染色，然后將細胞玻片放置于流動腔裝置內(nèi)，使用流動腔加載系統(tǒng)對破骨細胞施加1或10dyne/cm2大小流體剪切力作用10分鐘，并使用熒光顯微鏡記錄攝像，然后使用相關軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。
　　

5、 3、流體剪切力誘發(fā)破骨細胞鈣響應的機制研究。在體外培養(yǎng)條件下，在破骨細胞染色結束后，分別加入不同阻斷劑，包括阻斷細胞表面機械敏感鈣離子通道MSCC(MechanosensitiveCalciumChannel)、抑制細胞內(nèi)磷酸酯酶C(PLC)活性、阻斷細胞表面電壓敏感通道L-VSCC(L-typevoltage-sensitivecalciumchannel)、消耗盡細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)鈣離子、阻斷細胞表面的ATP受體、阻斷細胞的間隙連接、去

6、除細胞外鈣離子等7種條件后，觀察流體剪切力作用時破骨細胞鈣離子濃度變化情況，并與正常未加阻斷劑組進行比較分析來判斷鈣響應的機制。
　　 4、流體剪切力作用后破骨細胞功能產(chǎn)物的變化情況。使用Real-TimePCR技術檢測c-Fos基因在不同狀態(tài)細胞中的表達情況。使用WestemBlot技術檢測兩種與破骨細胞功能密切相關的蛋白（TRAP和NFATCl）在有、無流體剪切力刺激條件下的表達變化情況，其中NFATc1蛋白與破骨細胞鈣信號

7、變化密切相關。
　　 結果：1、MC3T3-E1細胞上清中可檢測到可溶型RANKL的表達，此上清可誘導RAW264.7細胞形成破骨細胞，且破骨細胞核數(shù)目與面積存在相關性，因而可根據(jù)細胞面積判斷其核數(shù)目。2、流體剪切力可誘發(fā)破骨細胞鈣響應的發(fā)生，這一響應的強度和形式與流體剪切力的大小、細胞分化程度和細胞核數(shù)目有相關性。3、阻斷破骨細胞的MSCC、抑制細胞內(nèi)磷酸酯酶C活性或耗盡內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)鈣離子后，流體剪切力所誘發(fā)的破骨細胞的鈣振蕩幾乎

8、完全消失；在去除掉細胞外鈣離子及阻斷細胞表面ATP受體條件下，部分細胞也會出現(xiàn)鈣響應，但一般只出現(xiàn)一個響應峰，無鈣振蕩的出現(xiàn)；阻斷細胞的間隙連接和電壓敏感通道后，流體剪切力所誘發(fā)的破骨細胞鈣振蕩強度和形式與正常組相比無明顯差別。4、與靜止狀態(tài)下破骨細胞相比，經(jīng)過流體剪切力刺激的破骨細胞其內(nèi)c-Fos基因和鈣振蕩相關蛋白NFATc1表達明顯升高，但TRAP蛋白的表達沒有變化。
　　 結論：1、MC3T3-E1細胞的上清培養(yǎng)液可以促

9、進RAW264.7細胞融合形成TRAP陽性、多核的破骨細胞。2、流體剪切力可誘發(fā)破骨細胞發(fā)生鈣振蕩，主要是通過激活細胞表面的機械敏感鈣離子通道，進而活化細胞內(nèi)的PLC酶，使IP3產(chǎn)生增加，促進內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)鈣離子釋放形成第一個鈣響應峰，胞外鈣離子內(nèi)流和ATP胞外擴散是形成隨后的鈣響應峰的必要條件；這種鈣振蕩會促進下游功能蛋白NFATc1的表達增加，使破骨細胞功能增強。3、與RANKL等因子類似，流體剪切力可作為一獨立因素誘發(fā)破骨細胞鈣響應的發(fā)