ODC和AdoMetDC雙反義腺病毒載體對食管癌細胞凋亡的影響.pdf

1、研究目的: 多胺是存在于所有生物中脂肪族多聚離子，主要包括腐胺（Put），精脒（Spd）和精胺（Spm）。是調(diào)節(jié)細胞生長的重要物質(zhì)，它可以通過改變DNA結(jié)構(gòu)和調(diào)節(jié)信號傳導途徑等方式調(diào)節(jié)基因的表達，從而在細胞生長和分化過程中發(fā)揮著重要的作用。細胞周期的維持也需要多胺的合成。鳥氨酸脫梭酶（ODC）和S-腺苷甲硫氨酸脫羧酶（AdoMetDC）是多胺生物合成的的關(guān)鍵酶。多數(shù)學者認為多胺的過度生成與腫瘤的發(fā)生有關(guān)。如果能有效減弱多胺在腫瘤

2、細胞中的過度表達，則可抑制腫瘤細胞的生長。因而研究抑制多胺合成的關(guān)鍵酶的方法就成了進來癌癥治療的熱點。本研究在成功構(gòu)建并擴增出ODC和AdoMetDC雙反義RNA腺病毒載體的基礎(chǔ)之上，研究鳥氨酸脫羧酶和S-腺苷甲硫氨酸脫羧酶雙反義腺病毒對食管癌細胞凋亡的影響，為進一步研究食管癌基因治療的方法提供理論依據(jù)和技術(shù)對策。 研究方法: ①構(gòu)建鳥氨酸脫羧酶（ODC）和S-腺苷甲硫氨酸脫羧酶（AdoMetDC）雙反義RNA腺病毒載體

3、。 ②重組腺病毒Ad-ODC-AdoMetDCas感染效率的測定。采用FACS檢測Ad-GFP感染細胞中GFP表達，以測定不同感染復數(shù)（MOI）的腺病毒對食管癌Eca109細胞的基因轉(zhuǎn)染效率。酶標儀（BIO-RAD Model 680）測定570nm處的吸光值。 ③應用MTT法實驗觀察Ad-ODC-AdoMetDCas對食管癌Eca109細胞生長增殖的影響。測定被不同感染復數(shù)重組腺病毒Ad-ODC-AdoMetDCas感

4、染細胞的增殖程度，并繪制不同感染細胞的生長曲線。 ④采用Western印跡檢測Eca109細胞轉(zhuǎn)染腺病毒（Ad-ODC-AdoMetDCas）后，其ODC和AdoMetDC蛋白表達的量。將食管癌Eca109細胞分別感染50 MOI的Ad-GFP，Ad-ODCas和Ad-ODC-AdoMetDCas 72 h后收集細胞。用裂解液抽提細胞總蛋白。蛋白樣品濃度采用BCA法測定。 ⑤采用HPLC法檢測食管癌Eca109細胞胞轉(zhuǎn)染

5、腺病毒（Ad-ODC-AdoMetDCas）后，其多胺的含量。收集107個細胞，用PBS沖洗兩遍后離心。將高氯酸加入到細胞沉淀中離心，取上清液。用HPLC系統(tǒng)測定多胺的含量。 ⑥應用TUNEL標記檢測法觀察Ad-ODC-AdoMetDCas對食管癌Eca109細胞凋亡的影響。腺病毒Ad-ODC-AdoMetDCas，Ad-ODCas和Ad-GFP分別以50MOI感染ECA109細胞后，用TUNEL試劑盒檢測細胞凋亡情況。

6、 ⑦應用透射電鏡進一步觀察細胞超微結(jié)構(gòu)的改變。 研究結(jié)果: ①基因轉(zhuǎn)染效率實驗結(jié)果顯示，以50MOI的Ad-GFP感染食管癌Eca109細胞48h后，大約有75％食管癌Eca109細胞GFP表達陽性，但不會引起細胞毒性。 ②重組腺病毒Ad-ODC-AdoMetDCas對食管癌Eca109細胞有劑量依賴性的抑制作用，根據(jù)實驗結(jié)果挑選食管癌Eca109細胞的感染滴度為50MOI。正常情況下食管癌Eca109細胞生長迅

7、速，而感染Ad-ODC-AdoMetDCas后細胞生長明顯減慢，細胞生長曲線更趨低平，最大生長抑制率可達70％，而無明顯細胞毒性。 ③采用Western印跡法顯示以Ad-ODC-AdoMetDCas感染食管癌Eca109細胞，可明顯抑制食管癌Eca109細胞中ODC和AdoMetDC基因表達，ODC和AdoMetDC含量明顯減少。 ④HPLC結(jié)果顯示，食管癌Eca109細胞感染Ad-ODC-AdoMetDCas后，細胞內(nèi)

8、三種多胺含量都明顯降低（p<0．05）。 ⑤TUNEL標記檢測結(jié)果證實，Ad-ODC-AdoMetDCas可引起食管癌Eca109細胞明顯凋亡。 ⑥透射電鏡下可見，典型的細胞凋亡特征，表現(xiàn)為細胞體積縮小，核皺縮、碎裂，染色質(zhì)呈塊狀邊集等。 研究結(jié)論: ODC和AdoMetDC雙反義腺病毒載體（Ad-ODC-AdoMetDCas）能顯著抑制食管癌細胞生長增殖，降低細胞多胺合成，促進細胞凋亡，為探討食管癌基因