蝙蝠葛酚性堿對原代培養(yǎng)大鼠皮層細胞及離體腦片氧糖剝奪損傷的保護作用及機制研究.pdf

1、目的：本研究通過建立原代培養(yǎng)大鼠皮層細胞和離體腦片氧糖剝奪(Oxygen-glucose deprivation,OGD)模型,觀察蝙蝠葛酚性堿(Phenolic alkaloids from Menispermum dauricum rhizome,PAM)在離體水平對OGD損傷的保護作用,并從細胞外谷氨酸(Glutamate,Glu)含量、細胞內活性氧(Reactive oxygen species,ROS)、線粒體膜電位(Mito

2、chondrial membrane potential,MMP)及相關興奮性氨基酸轉運體(Excitatory amino acid transporters,EAATs)的表達等方面,探討PAM對抗OGD損傷的保護作用及機制,為缺血性腦損傷相關疾病的治療提供新的靶點,同時也為其臨床應用提供可靠的實驗依據(jù)。
　　方法和結果：
　　第一部分蝙蝠葛酚性堿對原代培養(yǎng)大鼠皮層細胞氧糖剝奪損傷的保護作用及機制研究
　　離體腦缺

3、血模型采用原代培養(yǎng)大鼠皮層細胞的OGD模型。通過預實驗確定PAM的給藥劑量和給藥時間段。通過3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽[3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromide,MTT]比色法和乳酸脫氫酶(Lactate dehydrogenase,LDH)檢測來觀察PAM對OGD復氧(OGD-reoxygenation,OGD-R)所致大鼠皮層

4、細胞損傷的保護作用。采用高效液相色譜(High performance liquid chromatography,HPLC)熒光檢測技術測定原代培養(yǎng)大鼠皮層細胞培養(yǎng)液中Glu的含量。分別利用二氯二氫熒光素二乙酯(2’,7’-dichlorofluorescein diacetate,DCFH-DA)熒光探針和陽離子熒光羰花青染色劑(5,5’,6,6’,-tetrachloro-1,1’,3,3’tetraethylbenzimidaz

5、o1carbocyanine iodide,JC-1),運用流式細胞技術進行細胞內ROS和MMP的檢測,以期進一步探討PAM的保護作用機制。
　　根據(jù)預實驗結果選擇PAM(0.1,1,10μg/mL)三個劑量進行正式實驗,給藥時間點選在開始OGD時給藥并持續(xù)至復氧結束。結果顯示,PAM可以減輕OGD-R對大鼠皮層細胞的損傷。PAM可以有效降低OGD后細胞外液Glu含量的增加,在復氧6h后減少細胞內ROS的產生及降低MMP去極化程度

6、。
　　第二部分蝙蝠葛酚性堿對大鼠離體腦片氧糖剝奪損傷的保護作用及機制研究
　　大鼠離體腦片缺血模型采用OGD模型。通過2,3,5-三苯基氯化四氮唑(2,3,5-triphenyltetrazolium chloride,TTC)染色的方法檢驗PAM對離體腦片的保護作用。分別檢測皮層腦片和海馬腦片上EAATs中的膠質細胞谷氨酸轉運體1(Glial glutamate transporter-1,GLT-1)和興奮性氨基酸載體

7、1(Excitatory amino acid carrier1,EAAC1)的蛋白表達來探討PAM對OGD-R損傷的保護機制。
　　結果顯示,PAM(0.3,3,30μg/mL)可以有效減輕OGD-R對大鼠離體腦片的損傷。OGD-R可使皮層腦片和海馬腦片的GLT-1表達下降,EAAC1表達升高。而PAM除了在海馬腦片上對EAAC1無顯著影響之外,均可有效逆轉OGD-R對這兩種EAATs的影響。
　　結論:PAM在離體水平下