Pso P27抗原參與銀屑病機制探索及清熱涼血解毒法干預.pdf

1、目的：Pso P27抗原是一種在銀屑病患者鱗屑中提取的銀屑病相關抗原，由肥大細胞產生，在銀屑病皮損及外周血中以免疫復合物形式存在，與銀屑病病情密切相關，藥物治療后皮損區(qū)抗原表達可顯著下降，然而該抗原參與銀屑病發(fā)病的確切機制尚不明確。
　　清熱涼血解毒法治療銀屑病療效確切，多項臨床研究均支持了這一觀點。而且在前期研究中，我們發(fā)現它能夠有效降低Pso P27抗原在銀屑病患者皮損中的表達。因此，為了揭示清熱涼血解毒法治療銀屑病的分子生物

2、學基礎和科學內涵，為銀屑病的臨床治療實踐提供科學依據，本研究采用體外實驗的方法，以探索Pso P27抗原誘發(fā)銀屑病的內在機制，并且觀察清熱涼血解毒法體外干預效果。
　　內容：(1)pso p27抗原對銀屑病相關免疫細胞T細胞、PBMC細胞的增殖及細胞因子分泌的影響，及此兩種細胞上清液對Hacat細胞增殖的影響，以及清熱涼血解毒含藥血清對以上細胞增殖及細胞因子分泌的干預。
　　具體實驗方法如下：培養(yǎng)銀屑病患者T細胞、PBMC細

3、胞及人永生化角質形成細胞株Hacat，用pso p27抗原進行干預，分別采用MTT、WST-1及WST-8的方法檢測不同時點三種細胞的增殖度，并采用ELISA檢測方法，檢測T細胞及PBMC細胞因子分泌，包括IL-1、TFN-α。
　　采用大鼠含藥血清制備的方法，制備清熱涼血解毒含藥血清(生地、紫草、土茯苓、白花蛇舌草、大青葉、赤芍、丹皮等)，用不同濃度梯度含藥血清干預T細胞、PBMC細胞及Hacat細胞，觀察以上三種細胞的增殖情況

4、(檢測方法同前)。
　　(2)清熱涼血解毒藥物有效單體對Hacat細胞增殖及凋亡的影響。
　　選擇該方藥可能有效的四種單體：熊果酸(白花蛇舌草)、落新婦苷(土茯苓)、紫草素(紫草)及丹皮酚(牡丹皮)，以不同濃度干預Hacat細胞，以明確藥物單體對該細胞的干預作用。檢測指標包括：細胞增殖(WST-8)、細胞周期，細胞凋亡(流式細胞儀技術及免疫熒光技術均采用AV/PI雙染法)，RT-PCR觀察該四種單體對Hacat細胞促凋亡基因

5、Bax及抑凋亡基因Bcl-xl的影響。
　　結果：(1)Pso P27抗原在體外并不能有效誘導T細胞的活化，同時對其細胞因子的分泌亦無明顯影響，但是它在一定程度上可以促進PBMC細胞的體外增殖，誘導其TNF-α的分泌。同時，銀屑病患者PBMC上清液以及Pso p27干預后PBMC上清液均可以刺激Hacat細胞的體外增殖，且抗原干預后增殖效果更為明顯。而清熱涼血解毒含藥血清則能夠在一定程度上抑制T細胞、PBMC細胞以及Hacat細胞

6、的體外增殖，其抑制作用與含藥血清的濃度及劑量相關，只有當血清濃度達到20％時，其抑制作用才較為明顯，且其中以大濃度及陽性對照組為最顯著。與此同時，我們連續(xù)5日觀察了含藥血清對Hacat細胞增殖干預的影響中發(fā)現，其抑制效果與作用時間之間關系并不十分明確。
　　(2)中藥單體對Hacat細胞的干預研究中，熊果酸、紫草素及丹皮酚均能夠有效抑制Hacat細胞的體外增殖，且抑制作用與藥物濃度密切相關，而落新婦苷則對Hacat細胞具有體外促增

7、殖作用。在對Hacat細胞周期分布的影響中，前三者均可以對Hacat細胞產生周期阻滯，然而阻滯時期并不相同，如熊果酸可以將Hacat細胞阻滯于G1/G0期，而紫草素及丹皮酚則將Hacat細胞阻滯于G2/M期。由于落新婦苷對Hacat細胞具有促增殖作用，因此其對Hacat細胞的周期影響并不能用周期阻滯表示。它可以在一定程度上減少細胞G2/M期的含量，促使細胞及早進入G1/G0期。前三者還可以誘導Hacat細胞的凋亡，其凋亡率與正常對照組之

8、間具有顯著差異，而落新婦苷則可以抑制Hacat細胞的早期凋亡，其早期凋亡率與對照組比較具有顯著差異。在對Bcl-xl及Bax的干預作用中，四種單體干預效果均不同。熊果酸可以促進Bcl-xl的含量的升高，并降低Bax的含量，而紫草素則具有雙抑制作用，丹皮酚則具有雙促進作用，落新婦苷對它們的表達并無影響。
　　結論：
　　(1)Pso p27是銀屑病相關抗原之一，多項研究表明它參與銀屑病發(fā)病，然而具體機制尚不明確。
　　我

9、們認為它與T細胞的活化及相關細胞因子的釋放密切相關，然而實驗結果證明它并不能有效誘導T細胞的體外增殖及細胞因子的釋放，但卻可以對PBMC細胞產生促增殖及促細胞因子釋放的作用，同時還可以間接引起Hacat細胞的體外增殖。因此，我們認為Pso P27參與銀屑病的發(fā)病與PBMC細胞密切相關，活化后的PBMC細胞可以釋放相關細胞因子等，誘導銀屑病的發(fā)病。然而，PBMC為淋巴細胞、單核細胞等組成的一個多細胞群，Pso P27抗原確切作用的靶細胞尚

10、不完全明確，仍需要我們進一步通過實驗，加以發(fā)現與驗證。
　　(2)清熱涼血解毒含藥血清對銀屑病發(fā)病相關細胞的干預存在不穩(wěn)定性
　　清熱涼血解毒含藥血清對銀屑病發(fā)病的多種細胞均具有體外抑制增殖的作用，其生物效應的發(fā)揮與藥物濃度呈依賴關系。然而，由于中藥含藥血清的制備工藝較為繁瑣，涉及環(huán)節(jié)較多，穩(wěn)定性較差，因此我們應更加關注如何改進此中藥藥理學分析方法，使其能夠更好地為中藥復方的藥理及藥效研究服務。
　　此外，中藥復方干預

11、疾病多是多通路多靶位的，抑制相關細胞的體外增殖，僅僅是其作用機制的一個側面，我們還需要全面認識清熱涼血解毒含藥血清療效的發(fā)揮的作用機制。
　　(3)清熱涼血解毒中藥單體對Hacat細胞的增殖與凋亡作用各具特色
　　在本研究中我們檢測了中藥單體熊果酸、紫草素、丹皮酚及落新婦苷體外干預Hacat細胞，對其體外增殖、細胞周期分布、凋亡以及凋亡基因Bcl-xl與Bax表達的影響。
　　單體的藥物作用既存在相同點，又各有特色。其

12、中熊果酸、紫草素以及丹皮酚的作用，與白花蛇舌草、紫草以及丹皮在銀屑病治療中的作用效果基本保持一致，在體外實驗中仍能夠抑制Hacat細胞的增殖，同時促進其凋亡，但是對于凋亡基因Bax、Bcl的影響各不相同。
　　而落新婦苷在卻能夠體外促進Hacat細胞的增殖，并對其早期凋亡具有一定抑制能力，而對凋亡基因Bcl-xl及Bax的表達無影響。這與土茯苓治療銀屑病的臨床療效存在差異。我們考慮該單體可能并不是土茯苓治療銀屑病的有效單體，或者落