植物酯酶的篩選純化及其對農(nóng)藥敏感性的研究.pdf

1、本文在多種植物酯酶酶源篩選的基礎(chǔ)上，選擇大豆為最佳農(nóng)殘檢測用酶源，深入研究了大豆中植物酯酶的提取、純化方法，得到純的酯酶制品，并且系統(tǒng)探討了大豆酯酶的酶學(xué)特性。本研究還測定了大豆酯酶對甲胺磷、對硫磷等19種有機磷農(nóng)藥和克百威、抗蚜威等8種氨基甲酸酯類農(nóng)藥的敏感性和最低檢測限。研究結(jié)果如下： 1.通過對小麥、大豆、玉米、小米、大麥等植物種子中的總酯酶含量和其對農(nóng)藥的靈敏度兩個指標的比較，選擇大豆作為有機磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留檢測

2、的適宜酶源。與小麥以及其他農(nóng)作物種子比較，大豆種子中的總酯酶含量最高，對氧樂果、敵敵畏、甲胺磷、對硫磷、久效磷五種農(nóng)藥的檢測限分別為：0.1、0.05、0.05、0.0625、0.05mg/L，表明其靈敏性好，檢測限低，可以滿足這五種有機磷農(nóng)藥殘留檢測的需要。 2.本研究提出大豆酯酶的提純工藝路線為：大豆種子粉碎后，按1：5料液比加0.3mol/L，pH7.0的磷酸緩沖液，振蕩或攪拌處理30分鐘后，放置在4℃冰箱中浸提過夜，紗布

3、過濾后進行6000rpm至1000rpm的差速離心，收集上清液，用60％硫酸銨鹽析沉淀，經(jīng)透析、超濾濃縮后進行DEAE-32離子交換層析，收集酶活力峰，即得酯酶制品。 3.對大豆酯酶的酶學(xué)特性進行了研究。研究表明，大豆酯酶的最適溫度和pH值分別為30℃，pH值為7.5，大豆酯酶的熱穩(wěn)定性較差，高溫條件下極易失活，-20℃保存可以有效地保存酶的活力，失活較少，保存半年仍有42.6％的剩余活力，經(jīng)測定大豆酯酶的米氏常數(shù)為2.97μm

4、ol/L，酶分子由兩個亞基組成，兩個亞基的分子量分別為44.67KD和69.18KD。 4.建立了分光光度法檢測有機磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥的檢測體系。即：1.950mL的農(nóng)藥中加入0.5mL酶液，混勻后在30℃水浴中反應(yīng)10分鐘，取出試管，加入50μLa-乙酸萘酯丙酮溶液，混勻，在30℃水浴中反應(yīng)15分鐘，再加入0.5mL固蘭B鹽溶液，混勻放入30℃水浴中反應(yīng)10分鐘，然后在595nm波長處測定吸光度，同時蒸餾水作空白對照。