血管緊張素Ⅱ通過NF-κB上調巨噬細胞基質金屬蛋白酶誘導因子表達的實驗研究.pdf

1、研究背景及目的:
　　 臨床證據(jù)和病理學研究均表明,急性冠脈綜合征(acute coronary syndrome ACS)發(fā)病的病理機制為動脈粥樣硬化易損斑塊的破裂。易損斑塊在病理上表現(xiàn)為較薄的纖維帽和較大的脂質核心,其斑塊肩部浸潤了豐富的巨噬-泡沫細胞和基質金屬蛋白酶(metalloproteinases,MMPs)。如何檢測及防治易損斑塊是ACS治療中的關鍵,國際多中心大型臨床隨機實驗研究顯示:血管緊張素轉換酶抑制劑(AC

2、EI)能夠顯著降低心血管高危人群心肌梗死的發(fā)生率。然而其內(nèi)在機制不清楚。ACEI對心血管的保護作用源于對血管緊張素Ⅱ(AngiotensinⅡ AngⅡ)的抑制。AngⅡ作為腎素-血管緊張素系統(tǒng)的主要活性肽,可通過致炎癥、誘導細胞因子的表達等作用加劇動脈粥樣硬化的發(fā)展。
　　 由于易損斑塊破裂的主要原因為冠狀動脈的細胞外基質(extracellular matrix,ECM)的降解,而MMP是降解易損斑塊內(nèi)ECM的主要活性酶,所

3、以對MMPs在致易損斑塊破裂中的研究愈發(fā)深入。但MMPs有多個家族成員分子,探討其一種成員分子不可能詮釋易損斑塊形成和破裂的機制,試驗也證實單一MMPs抑制劑臨床應用沒有給冠心病患者帶來益處。最近研究發(fā)現(xiàn),細胞外基質金屬蛋白酶誘導因子(extracellular matrixmetalloproteinase inducer,EMMPRIN)參與了許多MMP成員的從頭合成,2002年Major等發(fā)現(xiàn)在動脈粥樣硬化斑塊中有EMMPRIN表

4、達,并參與了動脈粥樣硬化病變的發(fā)展,越來越多的證據(jù)表明EMMPRIN參與了動脈硬化病變過程。
　　 導師的前期系列研究結果顯示AngⅡ能通過轉錄因子核因子-κB(NF-κB)調控血管平滑肌細胞的MMPs的表達,參與了最終的斑塊破裂過程。但AngⅡ與MMPs誘導因子EMMPRIN是否存在聯(lián)系尚未見報道,因此本研究通過AngⅡ體外刺激巨噬細胞,觀察EMMPRIN的表達變化情況,并評價了NF-κB通路在這一調控過程中的作用。
　

5、　 方法
　　 1.細胞培養(yǎng)、誘導及鑒定
　　 人單核細胞株THP-1細胞采用含10％胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng),調整細胞數(shù)至5×106/L,加PMA(50μg/L)于培養(yǎng)液,轉入6孔培養(yǎng)板培養(yǎng)48 h,使懸浮細胞分化為貼壁生長的巨噬細胞。使用流式細胞術鑒定巨噬細胞誘導情況。細胞用于后續(xù)實驗。
　　 2.分組刺激及指標檢測:
　　 誘導成功后的巨噬細胞使用PBS清洗3次徹底清除PMA。更換10

6、％胎牛血清的RPMI1640繼續(xù)培養(yǎng)。使用AngⅡ分別以濃度梯度(1×10-8、1×10-7、1×10-6、1×10-5 mol/L)和時間梯度(6、12、24 h)刺激巨噬細胞,使用AT1R拮抗劑厄貝沙坦、AT2R拮抗劑PD123319、NF-κB抑制劑PDTC預處理細胞,檢測對AngⅡ刺激EMMPRIN表達的影響。收集細胞進行逆轉錄聚合酶鏈反應檢測EMMPRIN mRNA表達;使用Westemblot檢測EMMPRIN蛋白表達。

7、r>　　 3.RNA干擾技術沉默NF-κB p65亞基表達
　　 經(jīng)驗證有效的p65siRNA干擾序列成功轉染入THP-1細胞。6小時后使用熒光顯微鏡檢測轉染效率,48 h后收集細胞進行Western blot和EMSA檢測干擾效果。
　　 4.凝膠電泳遷移率實驗EMSA檢測NF-κB與DNA結合效率
　　 上述處理的細胞使用核蛋白提取液AB液提取核蛋白,Lowry's法測定蛋白含量。分組上樣在8％在非變性的聚

8、丙烯凝膠電泳上分離,檢測各組NF-κB與DNA結合活性。
　　 5.取等量的各處理組細胞在的無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h,收集上清液。根據(jù)細胞計數(shù)調整各組細胞培養(yǎng)上清液中的蛋白濃度,等量上樣行明膠電泳,凝膠依次行洗脫、染色,脫色,檢測MMP-9位于藍色背景上的透亮帶(92 KD)。
　　 結果
　　 1.THP-1巨噬細胞成功建立
　　 THP-1細胞為圓形懸浮細胞,經(jīng)PMA誘導后形狀變得不規(guī)則并伸出偽足的貼

9、壁細胞。更為重要的是誘導后的巨噬細胞表面高表達CD14。使用流式細胞術檢測細胞表面表達CD14鑒定THP-1誘導后的巨噬細胞。結果示THP-1經(jīng)PMA誘導48小時后,細胞表面CD14表達較未分化組高表達。
　　 2.AngⅡ刺激巨噬細胞后EMMPRIN表達上調
　　 THP-1誘導后的巨噬細胞成功后,分別以劑量和時間梯度使用AngⅡ刺激巨噬細胞,觀察EMMPRIN mRNA和蛋白表達情況。由于在PMA對THP-1的誘導過

10、程中能引起EMMPRIN的表達,巨噬細胞誘導成功后徹底去除PMA,PBS沖洗細胞3遍,并繼續(xù)完全培養(yǎng)基培養(yǎng)巨噬細胞數(shù)小時。
　　 以AngⅡ(1×10-8、1×10-7、1×10-6、1×10-5 mol/L)4個濃度刺激巨噬細胞后6h,分別以RT-PCR和Western blot檢測EMMPRIN mRNA和蛋白表達。結果顯示AngⅡ對EMMPRIN的上調有劑量依賴關系。
　　 以AngⅡ(1×10-6mol/L)刺激

11、巨噬細胞,分3個時相點檢測EMMPRIN表達。結果顯示相對于未刺激組,AngⅡ能在6 h引起EMMPRIN表達上調,并持續(xù)24 h。
　　 3.AT1R拮抗劑厄貝沙坦、AT2R拮抗劑PD123319于AngⅡ刺激細胞前30min預處理細胞,以AngⅡ(1×10-6mol/L)刺激細胞,6小時后收集檢測THP-1巨噬細胞EMMPRINmRNA及蛋白表達,結果顯示厄貝沙坦組EMMRPRIN表達量較正常AngⅡ刺激組明顯降低,而PD1

12、23319無明顯變化。結果顯示AngⅡ通過ATIR調控EMMPRIN的表達。
　　 4.AngⅡ上調EMMPRIN的表達有NF-κB通路的參與
　　 采用NF-κB抑制劑PDTC處理和NF-κ3亞基p65 RNA干擾的方法檢測NF-κB通路在AngⅡ上調EMMPRIN的表達中的作用。
　　 成功建立NF-κB亞基p65 RNA干擾模型。熒光顯微鏡檢測siRNA轉染效率,隨機選取THP-1巨噬細胞轉染照片,根據(jù)細胞

13、計數(shù),其轉染率平均值＞70％.
　　 p65干擾效率由Western blot檢測:結果顯示相對于其他對照組,p65干擾組p65的表達明顯下降。
　　 EMSA應用于檢測NF-κB的轉錄結合活性。使用TNF-α處理過的巨噬細胞為陽性對照。結果顯示AngⅡ能夠誘導THP-1巨噬細胞產(chǎn)生NF-κB活性,這一過程在NF-κB p65干擾組被抑制。
　　 通過EMMPRIN RT-PCR和Western blot檢測NF

14、-κB通路對AngⅡ上調EMMPRIN表達的影響。結果顯示在NF-κB抑制劑預處理組和p65干擾組,AngⅡ對巨噬細胞上調EMMPRIN的表達作用受到抑制。
　　 5.MMP-9活性變化與EMMPRIN表達變化一致
　　 選取上述各組刺激細胞提取上清液,行明膠酶譜法檢測MMP-9活性。結果顯示:AngⅡ刺激THP-1巨噬細胞后,MMP-9活性增高。在AT1R拮抗劑厄貝沙坦、NF-κB抑制劑PDTC及干擾NF-κB P65