SOCS3基因下調(diào)對(duì)追趕生長(zhǎng)IUGR大鼠肝細(xì)胞糖代謝調(diào)控及胰島素抵抗機(jī)制研究.pdf

1、本文內(nèi)容分為三部分：
　　第一部分原代大鼠肝細(xì)胞分離及培養(yǎng)鑒定
　　目的：建立一種相對(duì)簡(jiǎn)易的原代大鼠肝細(xì)胞分離及培養(yǎng)方法,并對(duì)肝細(xì)胞純度及生物活性進(jìn)行鑒定。
　　方法：原代大鼠肝細(xì)胞經(jīng)改良原位非循環(huán)兩步灌流法及多次過濾低速離心法分離后,再用常規(guī) DMEM高糖培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng);采用錐蟲藍(lán)拒染法檢測(cè)接種瞬時(shí)肝細(xì)胞的存活率,在倒置顯微鏡下觀察肝細(xì)胞形態(tài)變化。通過過碘酸-Schiff反應(yīng)(PAS)來檢測(cè)肝細(xì)胞糖原合成及儲(chǔ)備能力;

2、利用免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)肝細(xì)胞角蛋白18(CK-18)的表達(dá);聯(lián)合兩者判斷肝細(xì)胞純度。
　　結(jié)果：每只 SD大鼠可以獲1.38*108～1.74*108個(gè)肝細(xì)胞,肝細(xì)胞活性在接種瞬時(shí)大于90％。倒置顯微鏡下可觀察到接種后4h肝細(xì)胞基本貼壁,貼壁后肝細(xì)胞胞體變平變大,隨后鄰近的肝細(xì)胞相互靠攏形成島狀或條索狀結(jié)構(gòu)。肝細(xì)胞內(nèi)糖原經(jīng) PAS染色后被染成紅色顆粒狀或者片狀。CK-18經(jīng)抗 CK-18免疫細(xì)胞化學(xué)染色后呈棕黃色均勻分布于肝細(xì)胞內(nèi)

3、。通過 PAS染色及抗 CK-18免疫細(xì)胞化學(xué)染色后聯(lián)合鑒定肝細(xì)胞純度在95％左右。
　　結(jié)論：通過改良原位兩步非循環(huán)灌注法及多次過濾低速離心法成功分離并培養(yǎng)原代大鼠肝細(xì)胞,該方法相對(duì)容易操作,所培養(yǎng)肝細(xì)胞數(shù)量、活力和純度較高,可在具備普通細(xì)胞培養(yǎng)條件的實(shí)驗(yàn)室推廣應(yīng)用。
　　第二部分追趕生長(zhǎng) IUGR大鼠肝細(xì)胞 SOCS3和胰島素受體后轉(zhuǎn)導(dǎo)通路分子表達(dá)變化
　　目的：研究追趕生長(zhǎng)宮內(nèi)發(fā)育遲緩(CG-IUGR)大鼠肝細(xì)胞

4、中細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子3(SOCS3)和胰島素受體后信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中關(guān)鍵分子胰島素受體底物1(IRS1)、胰島素受體底物2(IRS2)、磷脂酰肌醇(-3)激酶(PI3K)、蛋白激酶 Akt2以及糖異生途徑關(guān)鍵酶磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(PEPCK)和葡萄糖-6-磷酸酶(G6Pase)的表達(dá)變化,初步探討追趕生長(zhǎng) IUGR大鼠胰島素抵抗的發(fā)生機(jī)制。
　　方法：采用孕期全程限食以及縮減每窩仔鼠數(shù)量的方法建立 CG-IUGR大鼠模型;評(píng)價(jià)

5、追趕生長(zhǎng)宮內(nèi)發(fā)育遲緩大鼠糖脂代謝狀態(tài);運(yùn)用改良原位兩步非循環(huán)灌流法分離并培養(yǎng)原代大鼠肝細(xì)胞;采用實(shí)時(shí)定量 PCR(RT-PCR)和Western blot檢測(cè)胰島素抵抗 CG-IUGR大鼠肝細(xì)胞于基礎(chǔ)狀態(tài)和胰島素刺激狀態(tài)下 SOCS3、IRS1、IRS2和PI3K在 mRNA和蛋白水平表達(dá)變化并評(píng)估胰島素刺激前后 Akt2磷酸化水平以及糖異生關(guān)鍵酶在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)變化。
　　結(jié)果：CG-IUGR大鼠肝細(xì)胞在基礎(chǔ)狀態(tài)和胰島素刺激狀態(tài)

6、下,SOCS3在 mRNA和蛋白水平表達(dá)量均較正常對(duì)照組高(P<0.05);IRS1和PI3K在 mRNA和蛋白水平表達(dá)量均較正常對(duì)照組低(P<0.05),而IRS2在 mRNA和蛋白水平表達(dá)量與正常對(duì)照組相比無明顯差異(P>0.05);磷酸化 Akt2表達(dá)水平均較正常對(duì)照組降低。胰島素刺激后對(duì)PEPCK和G6Pase轉(zhuǎn)錄水平的抑制作用在 CG-IUGR大鼠肝細(xì)胞較正常大鼠細(xì)胞降低。
　　結(jié)論：CG-IUGR大鼠肝細(xì)胞中SOCS3

7、表達(dá)量增加,通過負(fù)性調(diào)節(jié)下調(diào) IRS1的表達(dá)且下游的分子活化水平隨之降低;CG-IUGR肝細(xì)胞糖異生關(guān)鍵酶轉(zhuǎn)錄水平增高意味著胰島素敏感性降低且肝糖生成增多,這可能是 CG-IUGR大鼠發(fā)生以胰島素抵抗為核心的疾病分子機(jī)制之一。
　　第三部分 SOCS3表達(dá)下調(diào)對(duì)追趕生長(zhǎng) IUGR肝細(xì)胞胰島素受體后信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及糖代謝的影響
　　目的：探討轉(zhuǎn)錄水平下調(diào) SOCS3表達(dá)對(duì)追趕生長(zhǎng)宮內(nèi)發(fā)育遲緩大鼠(CG-IUGR)胰島素受體后信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)

8、通路關(guān)鍵分子表達(dá)變化以及葡糖糖代謝的影響。
　　方法：運(yùn)用孕期全程限食以及縮減每窩仔鼠數(shù)量的方法建立追趕生長(zhǎng)宮內(nèi)發(fā)育遲緩大鼠模型;大鼠肝細(xì)胞采用改良原位兩步非循環(huán)灌流法分離并培養(yǎng);以脂質(zhì)體為載體將針對(duì)大鼠SOCS3基因設(shè)計(jì)的特異性 siRNA分子(siSOCS3)轉(zhuǎn)染至 CG-IUGR大鼠肝細(xì)胞中,采用實(shí)時(shí)定量 PCR(RT-PCR)和Western blot篩選出最有效干擾分子;干擾后48h,檢測(cè) CG-IUGR大鼠肝細(xì)胞于基礎(chǔ)

9、狀態(tài)和胰島素刺激狀態(tài)下 IRS1、PI3K蛋白水平和Akt2磷酸化水平表達(dá)變化并用RT-PCR評(píng)估干擾后對(duì)糖異生關(guān)鍵酶轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)的影響。
　　結(jié)果：干擾后48h,CG-IUGR大鼠肝細(xì)胞在基礎(chǔ)狀態(tài)和胰島素刺激狀態(tài)下,IRS1和PI3K蛋白水平表達(dá)量均較干擾前高(P<0.05);磷酸化 Akt2表達(dá)水平均較干擾前增高?；A(chǔ)狀態(tài)下,CG-IUGR大鼠肝細(xì)胞 PEPCK和G6Pase轉(zhuǎn)錄水平于干擾后較干擾前降低,但差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義