鄱陽湖流域并殖吸蟲宿主動物華溪蟹屬淡水蟹類DNA條形碼的初步研究.pdf

1、目的：探討運用DNA條形碼標(biāo)準(zhǔn)序列進(jìn)行鄱陽湖流域并殖吸蟲宿主動物華溪蟹屬淡水蟹類分類鑒定的可行性，為淡水蟹分類鑒定提供一個標(biāo)準(zhǔn)化的分子分類參照模式。
　　方法：根據(jù)不同取材部位對DNA提取效果的影響，優(yōu)化華溪蟹屬淡水蟹類DNA的提取。根據(jù)華溪蟹屬物種間地理分布、生境模式的差異性，選取分布于鄱陽湖流域的福建華溪蟹（Sinopotamon fukienense）、萬載華溪蟹（S. wanzaiense）、修水華溪蟹（S. xiushu

2、iense）、斜緣華溪蟹（S. obliquum）、蘭氏華溪蟹（S. lansi）以及資溪華溪蟹（S.zixiense）6個代表性物種，采用線粒體COI、16S rDNA基因片段以及核基因片段ITS2作為分子標(biāo)記，結(jié)合GenBank數(shù)據(jù)庫中同屬序列片段，經(jīng)DNA提取、引物篩選、PCR擴(kuò)增、產(chǎn)物純化測序及測序數(shù)據(jù)處理和分析，在計算得到的遺傳距離和所構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹基礎(chǔ)上進(jìn)行華溪蟹DNA條形碼標(biāo)準(zhǔn)基因的選擇。
　　結(jié)果：使用試劑盒法提取

3、華溪蟹屬淡水蟹類步足肌肉，DNA提取濃度可達(dá)30 ng/μL，DNA提取效果穩(wěn)定可靠。在本實驗涉及的淡水蟹類個體及類群的識別上，選擇16S rDNA基因片段作為DNA條形碼標(biāo)準(zhǔn)基因，對DNA模板的完整性等質(zhì)量要求較高，陳舊樣本提取的DNA無法保證理想的PCR擴(kuò)增效率；而ITS2擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳則顯示種間序列存在長度多態(tài)性。故16S rDNA和ITS2基因片段不適宜作為華溪蟹類物種的DNA條形碼標(biāo)準(zhǔn)基因。COI基因片段擴(kuò)增效率為100％

4、，擴(kuò)增效果最為穩(wěn)定，且測序結(jié)果分析大小一致，無插入及缺失，結(jié)合GenBank部分華溪蟹屬序列數(shù)據(jù)分析，可區(qū)分本次研究所涉及的75％的物種，提示COI基因片段較16S rDNA、ITS2基因更適合作為鑒定華溪蟹類物種的DNA標(biāo)準(zhǔn)序列。
　　結(jié)論：
　　1.使用試劑盒法提取華溪蟹屬淡水蟹類步足肌肉，可獲得穩(wěn)定可靠的DNA提取效果。
　　2.COI基因片段較16S rDNA、ITS2基因更適合作為鑒定華溪蟹類物種的DNA標(biāo)準(zhǔn)

5、序列，可作為華溪蟹屬淡水蟹類物種鑒定的輔助分類工具。
　　3.研究涉及的COI基因片段序列A、T含量高達(dá)66.0%，有AT偏向，呈現(xiàn)后生動物線粒體基因典型的AT偏好特點。
　　4. COI基因片段序列實驗組數(shù)據(jù)計算建立的分支樹顯示：本次實驗測序的S. fukienense與GenBank數(shù)據(jù)庫下載的AB433578.1（S. fukienense COI基因片段）分為與其他7種華溪蟹無交叉的2支，若AB433578.1定種準(zhǔn)

6、確，提示極有可能在標(biāo)本的補(bǔ)充采集及形態(tài)學(xué)測量比對基礎(chǔ)上發(fā)現(xiàn)隱存物種（亞種）。
　　5.基于S. lansi COI基因數(shù)據(jù)建立的分支樹，顯示贛東、贛北、贛中地區(qū)S. lansi先與湖北地區(qū)S. lansi并系為一支，該支進(jìn)而與贛西、贛南地區(qū)S. lansi形成并系，并未顯示出長江對S. lansi的地理阻隔作用，反而顯示S. lansi種群沿大小水系擴(kuò)散現(xiàn)象，結(jié)合S. lansi主要生活在大型河流、湖泊生境，及體型較大、活動能力強(qiáng)