青楊脊虎天牛細(xì)胞色素P450基因的克隆與表達(dá)及氰戊菊酯對(duì)其的誘導(dǎo)作用.pdf

1、細(xì)胞色素P450單加氧化酶系在生物體對(duì)外源化合物的代謝和內(nèi)源化合物的調(diào)節(jié)都起著非常重要的作用，許多證據(jù)表明昆蟲(chóng)殺蟲(chóng)劑抗性的產(chǎn)生與單加氧化酶系介導(dǎo)的代謝反應(yīng)有關(guān)，其關(guān)鍵組份細(xì)胞色素P450作為終端氧化酶能氧化多樣的底物。青楊脊虎天牛是一種危害楊樹(shù)、柳樹(shù)等多種闊葉樹(shù)的蛀干性害蟲(chóng)，在我國(guó)東北局部地區(qū)造成了嚴(yán)重的危害。為深入了解青楊脊虎天牛細(xì)胞色素P450的結(jié)構(gòu)與功能，就青楊脊虎天牛細(xì)胞色素P450基因的克隆、表達(dá)及誘導(dǎo)開(kāi)展了研究，主要研究結(jié)果

2、如下：
　　根據(jù)報(bào)道的十幾種昆蟲(chóng)CYP4家族基因的氨基酸序列的保守區(qū)域設(shè)計(jì)一對(duì)引物，采用RT-PCR方法以青楊脊虎天牛中腸為材料提取mRNA，克隆了青楊脊虎天牛CYP4G2基因(GenBank登錄號(hào):EF429250)。序列分析表明，青楊脊虎天牛CYP4G2基因編碼區(qū)閱讀框全長(zhǎng)387bp，編碼129個(gè)氨基酸殘基，預(yù)測(cè)分子量和等電點(diǎn)分別為16.9KD和5.75;推導(dǎo)的氨基酸序列與已報(bào)道的昆蟲(chóng)CYP4家族氨基酸序列同源性較高(63％～

3、86％)經(jīng)與已知CYP4家族其它幾乎所有成員氨基酸同源比對(duì)發(fā)現(xiàn)，青楊脊虎天牛CYP4G2基因與馬鈴薯甲蟲(chóng)和赤擬谷盜親源關(guān)系最近。
　　將青楊脊虎天牛CYP4G2基因克隆進(jìn)原核表達(dá)載體pET-28a(+)，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌JM109細(xì)胞中，經(jīng)0.3 mmol/L IPTG誘導(dǎo)蛋白質(zhì)表達(dá)。SDS-PAGE電泳分析表明在約22kD大小位置，轉(zhuǎn)化青楊脊虎天牛CYP4G2基因的JM109菌與對(duì)照J(rèn)M109菌和空pET-28a(+)轉(zhuǎn)化JM10

4、9菌相比都出現(xiàn)了一條特異性的蛋白質(zhì)條帶，與預(yù)期大小一致，推測(cè)青楊脊虎天牛CYP4G2基因在大腸桿菌中得到表達(dá)。
　　將氰戊菊酯配制成2mg/g的濃度，點(diǎn)滴于青楊脊虎天牛體壁，處理不同時(shí)間后取對(duì)照和經(jīng)氰戊菊酯處理的成蟲(chóng)解剖，分別測(cè)定體壁、中腸、脂肪體的P450含量。結(jié)果表明氰戊菊酯對(duì)P450酶系中不同的組分具有不同的誘導(dǎo)作用，對(duì)中腸P450含量的誘導(dǎo)最為顯著，并表現(xiàn)出了復(fù)雜的誘導(dǎo)機(jī)制。
　　青楊脊虎天牛CYP4G2基因的成功克