PTD-HBcAg融合蛋白誘導特異性CTL抑制HBV復制的實驗研究.pdf

1、乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)是一種非細胞病變性的具有包膜的雙鏈DNA病毒，其感染肝細胞引發(fā)的急、慢性肝炎是人體免疫系統(tǒng)在清除HBV感染的過程中對肝細胞破壞的結果。在免疫系統(tǒng)清除肝細胞中HBV時，起核心作用的是HBV特異性細胞毒T淋巴細胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)，活化的CTL通過兩條途徑清除病毒：胞溶途徑—分泌穿孔素、顆粒酶等細胞毒分子直接殺傷病毒感染的靶細胞或者Fas/Fas

2、L途徑介導靶細胞凋亡，非胞溶途徑—分泌細胞因子抑制病毒復制。對于肽疫苗而言，如何將外源性抗原肽有效導入抗原提呈細胞(antigen presenting cell，APC)內主要組織相容性復合物(major histocompatibility complex，MHC)-I類抗原提呈途徑是激發(fā)特異性CTL應答的關鍵。被MHC-I類分子提呈的抗原肽大多數來源于胞漿中合成的蛋白，所以理論上，若促進外源性抗原肽進入抗原提呈細胞(APC)胞漿，

3、則可望相應增強抗原肽被MHC-I類分子提呈的效率。近來有學者發(fā)現有些蛋白具有很強的不依賴于受體的跨膜活性，這類具有跨膜活性的轉運區(qū)域短肽稱為細胞穿膜肽或穿透肽(cell penetrating peptide，CPP)。目前研究最為透徹應用最為廣泛的細胞穿透肽是HIV-Tat(human immunodeficiericy virustransactivator of transcription)蛋白；PTD(protein trans

4、duc-tion domain)是Tat蛋白行使跨膜功能的核心片段，包含該區(qū)段的蛋白具備穿透細胞膜的功能。盡管穿透肽的跨膜機制還不明確，但大量試驗已證實它是一種很有前景的跨膜轉運工具。諸多研究證實，PTD及其衍生體能夠有效穿透細胞膜，高效攜帶外源性抗原進入細胞內部，實現細胞亞定位，通過MHC-I類分子途徑提呈，誘導特異性CTL，從而發(fā)揮抗腫瘤、抗病毒作用。通過構建表達與細胞穿透肽融合的重組蛋白，可以在體內外將不同蛋白和多肽轉導入多種細胞

5、。本研究以前期構建PTD-HBcAg融合基因質粒為基礎，利用PTD-HBcAg融合蛋白體外刺激樹突狀細胞(dendritic cell，DC)成熟并誘導特異性CTL，體內免疫HBV轉基因小鼠，對PTD-HBcAg融合蛋白誘導特異性CTL抑制HBV復制的免疫功能進行了探討。 實驗共分三部分：(1)PTD-HBcAg融合蛋白體外誘導小鼠髓源性樹突狀細胞成熟及在T淋巴細胞增殖中的作用；(2)PTD-HBcAg融合蛋白誘導特異性CTL反

6、應抑制HBV復制的體外研究；(3)PTD-HBcAg融合蛋白誘導特異性CTL抑制轉基因小鼠HBV復制的研究。 第一部分 PTD-HBcAg融合蛋白體外誘導小鼠髓源性樹突狀細胞成熟及在T淋巴細胞增殖中的作用 目的：觀察融合蛋白PTD-HBcAg誘導體外培養(yǎng)的小鼠髓源性樹突狀細胞成熟及對T淋巴細胞增殖的作用。 方法：體外分離培養(yǎng)近交系Balb/c小鼠髓源性DC，加重組小鼠粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(Granuloc

7、yte-macrophage colony-stimulating factor， GM-CSF)、重組白細胞介素(interleukin，IL)-4培養(yǎng)5 d，再加入腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)-α、HBcAg和PTD-HBcAg誘導樹突狀細胞成熟。激光共聚焦顯微鏡觀察免疫熒光在細胞中的分布及定位，流式細胞儀測定樹突狀細胞表面分子表達，ELISA法測定樹突狀細胞培養(yǎng)上清中IL-12p70的水平，C

8、ell Counting Kit-8(CCK8)試劑盒檢測T淋巴細胞增殖反應。兩組間均數比較采用t檢驗。 結果：體外成功誘導培養(yǎng)小鼠髓源性樹突狀細胞，HBcAg主要定位于樹突狀細胞膜表面而PTD-HBcAg能夠穿透樹突狀細胞膜表面進入細胞內。PTD-HBcAg能明顯上調樹突狀細胞表面分子CD80、CD86和MHC-II類分子表達；50μ g/ml和100μ g/ml PTD-HBcAg誘導樹突狀細胞分泌IL-12p70水平分別為

9、142.5±18.31 pg/ml和124.3±15.12 pg/ml，明顯高于50μ g/ml HBcAg組(42.31±4.213 pg/ml，t=9.2342和9.0448，p<0.05)；PTD-HBcAg誘導樹突狀細胞刺激T細胞增殖能力明顯高于HBcAg組及陽性對照TNF-α組。 結論：PTD-HBcAg具有穿透樹突狀細胞膜能力并促進樹突狀細胞分化、成熟，明顯上調表面共刺激分子表達，增強樹突狀細胞刺激T細胞增殖及分泌I

10、L-12p70能力。 第二部分 PTD—HBcAg融合蛋白誘導特異性CTL反應抑制HBV復制的體外研究 目的：探討經PTD-HBcAg融合蛋白致敏的樹突狀細胞體外誘導特異性細胞毒T淋巴細胞(CTLs)對HBV的抑制作用。 方法：體外分離培養(yǎng)小鼠髓源性樹突狀細胞，加入不同融合蛋白刺激樹突狀細胞成熟后與T淋巴細胞共培養(yǎng)，ELISA法檢測T淋巴細胞上清中IL-2、IL-4、IL-10和干擾素(interferon，IN

11、F)-γ的分泌水平，流式細胞儀檢測胞內細胞因子水平，乳酸脫氫酶(LDH)釋放試驗檢測特異性CTL活性，并對HepG2.2.15細胞培養(yǎng)上清中HBsAg及HBV DNA水平進行檢測。 結果：經不同融合蛋白刺激的樹突狀細胞能有效促進T淋巴細胞的細胞因子分泌，同時融合蛋白PTD-HBcAg組中IL-2(552.7±117.5 pg/ml)和INF-γ(150.6±7.945 pg/ml)明顯高于HBcAg組中IL-2(420±12.4

12、7 pg/ml)和INF-γ(107.5±12.19 pg/ml)分泌。流式細胞儀檢測PTD-HBcAg融合蛋白誘導的CTL水平明顯高于對照組。經PTD-HBcAg融合蛋白組誘導的CTL比HBcAg誘導的CTL有明顯的特異性殺傷作用，同時對HBsAg及HBV DNA水平有明顯的抑制作用。 結論：經PTD-HBcAg融合蛋白致敏的樹突狀細胞能有效刺激T淋巴細胞分泌細胞因子及增加CTLs的表達，并增強特異性CTL活性及對HepG2.

13、2.15細胞上清中HBsAg及HBV DNA水平的抑制。 第三部分 PTD—HBcAg融合蛋白誘導特異性CTL抑制HBV轉基因小鼠病毒復制的研究 目的：探討PTD-HBcAg融合蛋白體內誘導特異性細胞毒T淋巴細胞(CTLs)對HBV轉基因小鼠HBV病毒的抑制作用。 方法：HBV轉基因小鼠隨機分組，融合蛋白PTD-HBcAg及對照蛋白HBcAg經皮下免疫小鼠，每周一次共三次。流式細胞儀檢測脾細胞中胞內細胞因子水平、

14、酶聯免疫吸附法(ELISA)檢測血清中乙肝表面抗原(HBsAg)水平、熒光定量聚合酶鏈反應(PCR)檢測HBV DNA水平。肝臟HE染色及免疫組織化學方法檢測HBsAg表達。 結果：PTD-HBcAg融合蛋白免疫轉基因小鼠后，能有效上調特異性CTL數量，肝組織中炎性細胞的數量明顯增多，同時對小鼠血清中HBsAg及HBV DNA水平有明顯的抑制作用。肝組織HBsAg免疫組織化學蛋白平均吸光度分析顯示，50μ g和100μ g PT

15、D-HBcAg融合蛋白組中平均吸光度值分別為128.28±0.98和117.31±1.21，明顯低于空白組和50μ g HBcAg組的154.44±3.12和135.66±1.89，F=50.77，p<0.05，組間比較差異有統(tǒng)計學意義。 結論：PTD-HBcAg融合蛋白免疫HBV轉基因小鼠后能增加特異性CTIL數量，顯著降低血清中HBsAg及HBV DNA水平，同時抑制肝臟中HBsAg的表達，在HBV免疫治療中具有抗病毒作用。