膀胱癌復發(fā)與多基因位點關聯(lián)性的研究.pdf

1、膀胱癌是一種常見的惡性腫瘤，具有較高的發(fā)病率和復發(fā)率。目前已有少數(shù)使用全基因組關聯(lián)研究(GWAS)篩選膀胱癌發(fā)病相關基因的報道，而尚未見通過該方法篩選膀胱復發(fā)相關基因的報道。本課題通過“膀胱癌發(fā)病相關基因的驗證”和“膀胱癌復發(fā)相關基因位點的篩選”兩個部分的研究，驗證了部分已被報道的膀胱癌發(fā)病相關位點，并篩選出了部分膀胱癌復發(fā)相關位點，同時明確了GWAS作為膀胱癌復發(fā)相關基因篩選方式的可行性。
　　 第一部分膀胱癌發(fā)病相關基因的驗

2、證
　　 目的：通過以全基因組關聯(lián)研究(GWAS)為核心的分子遺傳學手段，結合臨床資料的總結與分析，在中國人群中驗證部分已經(jīng)被報道的可能與膀胱癌發(fā)病有關的單核苷酸多態(tài)性(SNP)位點，同時探討在中國人群中使用該方法研究不同組別人群間基因差異的可行性。
　　 材料和方法：自2010年起于復旦大學附屬華山醫(yī)院泌尿外科招募膀胱癌患者共164名(均經(jīng)病理學檢驗證實為尿路上皮癌)，在告知患者實驗目的、征得患者同意并簽署知情同意書的

3、情況下，采取每名患者靜脈血5ml，另外選取1008名經(jīng)確認未罹患腫瘤的健康對照志愿者，同樣在簽訂知情同意書之后，每人抽取5ml靜脈血。選取目前已經(jīng)被報道過的16個可能與膀胱癌發(fā)病有關的SNPs作為重點關注對象。膀胱癌患者及健康對照志愿者提供的5ml靜脈血置入乙二胺四乙酸二鉀(EDTA)抗凝管中，立刻混勻，離心，吸除血清，獲得血細胞，提取外周血樣本總RNA，逆轉錄得到cDNA的并純化，合成cRNA，純化、標記并片段化，行芯片雜交，最終進行

4、芯片掃描。對上述患者進行詳細的臨床資料總結，包括姓名、性別、年齡、吸煙史、初次確診日期、術中所見、術后病理結果。對健康對照志愿者，同樣登記姓名、性別、年齡、吸煙史等資料，并將之與患者的資料進行對比。使用PLINK軟件，對數(shù)據(jù)進行分析，行Fisher確切概率法檢驗，根據(jù)檢驗結果，對上述SNPs基因型的分布進行Hardy-Weinberg(HWE)平衡檢驗。同時應用Logistic回歸模型，校正年齡、吸煙史等因素，計算比值比(OR)和95％

5、置信區(qū)間。
　　 結果：通過對患者組及對照組臨床資料的分析，我們確定，兩者在性別、年齡、吸煙史等方面無統(tǒng)計學差異。通過對膀胱癌患者及健康對照志愿者在上述16個SNPs中的比較，我們發(fā)現(xiàn)了2個在患者組與對照組之間，等位基因分布存在統(tǒng)計學差異的SNPs，他們分別是位于4號染色體短臂1區(qū)6帶，定位于tacc-3基因的第5個內(nèi)含子中的rs798766(C＞T，p=0.00163)和位于8號染色體長臂2區(qū)4帶，定位于myc基因上游約的rs

6、9642880(G＞T，p=0.04587)。同時還發(fā)現(xiàn)具有存在統(tǒng)計學差異潛質(zhì)的SNP--定位于psca基因的第1個外顯子中的rs2294008(C＞T)。
　　 結論：rs798766、rs9642880以及rs2294008在患者組和對照組之間表現(xiàn)出了不同程度的等位基因分布差異性，這提示上述SNPs有望成為膀胱癌的基因診斷標志。同時，這一部分的研究證明，通過GWAS技術在中國人群中，尋找不同組別見部分SNPs等位基因分布的差

7、異是切實可行的。
　　 第二部分膀胱癌復發(fā)相關基因位點的篩選
　　 目的：以上述第一部分的研究結果作為基礎，通過以GWAS為核心的分子遺傳學手段，結合臨床資料的總結與分析，在中國人群中篩選可能與膀胱癌復發(fā)有關的單核苷酸多態(tài)性(SNP)位點，同時探討以基因芯片作為核心技術，在中國人群中篩選膀胱癌復發(fā)相關基因位點的可行性。
　　 材料與方法：選取上述164名膀胱癌患者，根據(jù)其膀胱癌復發(fā)與否，分為復發(fā)組(40人)和非復

8、發(fā)組(124人)，將他們提供的5ml靜脈血置入乙二胺四乙酸二鉀(EDTA)抗凝管中，立刻混勻，離心，吸除血清，獲得血細胞，提取外周血樣本總RNA，逆轉錄得到cDNA的并純化，合成cRNA，純化、標記并片段化，行芯片雜交，最終進行芯片掃描。仍然選取目前已經(jīng)被報道過的16個可能與膀胱癌發(fā)病有關的SNPs作為重點關注對象。對上述患者進行詳細的臨床資料總結，包括姓名、性別、年齡、吸煙史、初次確診日期、術中所見(腫瘤數(shù)目、形態(tài)、大小等)、術后病理

9、結果、復發(fā)時間、復發(fā)次數(shù)，并將復發(fā)組與非復發(fā)組的資料進行對比。使用STATA12.0和PLINK軟件，對數(shù)據(jù)進行分析，行X2檢驗Fisher確切概率法檢驗，根據(jù)檢驗結果，對上述SNPs基因型的分布進行Hardy-Weinberg(HWE)平衡檢驗。同時應用Logistic回歸模型，校正年齡、吸煙史等因素，計算比值比(OR)和95％置信區(qū)間。
　　 結果：通過對復發(fā)組和非復發(fā)組臨床資料的分析，我們確定，兩者在性別、年齡、吸煙史、腫

10、瘤的分期、分級、手術方式的選擇等方面無統(tǒng)計學差異。通過對復發(fā)組和非復發(fā)組在上述16個SNPs中的比較，在基因型比較中，我們發(fā)現(xiàn)了2個SNPs的特定基因型對膀胱癌的復發(fā)具有保護作用，它們分別是位于8號染色體短臂2區(qū)2帶的rs1495741(GG基因型，p=0.013)以及位于19號染色體長臂1區(qū)3帶的ercc-2基因中的rs13181(GT基因型，p=0.024)；在等位基因分析中，我們發(fā)現(xiàn)位于19號染色體長臂1區(qū)3帶上的ccne-1基因